一例肺炎克雷伯氏菌引起山羊死亡診斷報告

黃宇 何宏勇 李軍 段振華 甘一波 唐第深 吳翠蘭 閉炳芬 潘艷*

（1，廣西玉林市動物疫病預防控制中心 537000；2，廣西獸醫研究所 530001；3，廣西獸醫生物技術重點實驗室 530001）

猝死癥在近幾年是比較盛行的一種疾病，其表現為家畜突然死亡，豬牛羊等易發生該病。猝死癥的發病特點是急、病程短、死亡快。中毒因素、多種細菌及病毒混合感染因素、營養因素、應激等因素都可造成猝死癥。該病給養殖業帶來巨大的經濟損失。

2017年7月，廣西玉林市某養殖戶送檢一份羊病料。通過對該病料進行剖檢和實驗室診斷，最終確定該病例是由肺炎克雷伯菌引起的，然后對其他山羊進行防治性措施，得到較好效果，現將具體的診斷方法和防治方法報道如下。

1 發病情況

2017年7月11日，廣西玉林市某養殖戶山羊場發現1只羊表現為精神沉郁、呼吸急促、體溫正常，然后對其進行用藥治療，經過4h后，該羊死亡。第3天又有2只羊死亡。該養殖戶立即送病死羊進行疫病檢測。

2 病理變化

剖檢發現除肺臟有出血外，其他臟器無明顯的病理變化。

3 材料與方法

3.1 材料

3.1.1 主要儀器和試劑

PCR儀、凝膠成像系統，購自Bio-rad公司；血平板、胰蛋白胨大豆肉湯、麥康凱瓊脂，購自北京路橋技術有限責任公司；細菌DNA提取試劑盒、2×Taq MasterMix、DNA Marker100 bp Ladder、快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒等，均購自北京康為世紀生物科技有限公司；藥敏紙片，購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

3.1.2 試驗動物

10只健康小鼠，購自廣西中醫藥大學。

3.1.3 引物

[1]將16SrRNA細菌鑒定引物序列由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，擴增片段大小約為1500bp，引物序列信息如下：

27F： 5’ -AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’

1492R： 5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3’

3.2 診斷方法

3.2.1 細菌分離和鑒定

將肺組織劃線接種于血平板上，置于37℃培養24h后有菌生長。再從中挑取單個菌落接種于麥康凱培養基上置于37℃培養24h也有菌生長。然后挑取單個菌落革蘭氏染色后、鏡檢，觀察細菌形態；同時用細菌抽提試劑盒抽提DNA，以此為模板，用細菌鑒定引物16SrRNA對其進行擴增、克隆、測序。

3.2.2 致病性試驗

將10只小鼠隨機分成2組，每組5只。一組用純細菌培養物進行腹腔注射接種的試驗組，劑量為0.3ml/只 （3×108CFU）；另一組為無菌的純培養液腹腔注射接種的對照組，劑量為0.3ml/只，觀察小鼠的生長狀況。

3.2.3 藥敏試驗

用環丙沙星、林可霉素、氧氟沙星、青霉素G等10種常用抗菌藥物對分離菌進行藥敏試驗，置于37℃培養24h，觀察抑菌效果。

4 結果

4.1 細菌分離及形態學結果

血平板上生長單一白色黏稠菌落且不溶血，從中挑取單一菌落接種于麥康凱平板，其有奶油狀菌落生長，經鏡檢為革蘭氏陰性、短桿菌。

4.2 PCR結果

對該菌的16srRNA進行PCR擴增、電泳 （附圖），然后用膠回收試劑盒進行回收、克隆、測序及將測序結果進行比對，該分離株與肺炎克雷伯氏菌同源性達98%，因此，鑒定該細菌為肺炎克雷伯氏菌。

附圖 細菌分離株電泳結果圖

4.3 致病性試驗

試驗組接種菌4h后，小鼠開始表現為精神萎靡、不好動且行動緩慢等癥狀，24h內小鼠全部死亡；對照組小鼠無異常變化。對死亡小鼠進行解剖，發現肺表面有出血，將肺進行血平板劃線培養，回收到該細菌。

4.4 藥敏試驗結果

根據文獻[2]藥敏試驗結果的判斷標準抑菌圈直徑為20～30mm，判斷為高敏藥物；抑菌圈直徑為10～20mm，判定為中敏藥物；抑菌圈直徑為7～9mm，判定為中敏藥物；無抑菌圈，判定為不敏感藥物。從附表可知，該菌對頭孢曲松高敏；對環丙沙星、頭孢拉定、氧氟沙星、鏈霉素和大觀霉素中敏；對強力霉素、氨芐西林、林可霉素、青霉素G不敏感。

5 討論

本次所檢測的病例，經細菌分離和PCR鑒定、致病性試驗和藥物敏感性試驗，最終確定該病例是由肺炎克雷伯氏菌引起山羊的死亡。

1882年，由Friediander等從病人肺中首次分離到革蘭氏陰性腸桿菌科克雷伯氏菌屬的條件致病性菌肺炎克雷伯氏菌[3]，隨后，陸續從豬、牛、羊、水貂、蟒蛇、鯉魚等動物都有報道該病原菌[4-8]，說明該病原不僅能感染人和家畜，還可以感染野生動物和水生動物。患畜感染該病原時，常引起敗血癥、肺炎、化膿性腦膜炎等疾病[4]。肺炎克雷伯氏菌病本為呼吸道、腸道的常見菌，但飼養環境條件差和牛羊運輸過程中產生的應激都會直接導致機體功能下降，進而可引起肺炎克雷伯氏菌的入侵，可引發多種病原感染，比如大腸桿菌、溶血性曼氏桿菌。本次病例發病急、死亡快、肺出血，這與許惠等[4]的報道一致。

致病性試驗中，試驗組小鼠在24h內完全死亡，說明該菌株致病性極強，這可能與該菌的毒力因子 （菌毛、莢膜多糖等）有關[3]。王秀坤等[3]報告，菌毛具有黏附作用，其可以與宿主表面受體作用進而促使細菌成功進入宿主體內進行繁殖和定居；而莢膜多糖不僅可以保護病原菌，還可以抑制宿主的免疫應答能功能。對于該菌的致病因子是哪個，還待于進一步研究。

隨著養殖行業快速發展，濫用抗生素已非常普遍。該養殖戶在發現該羊出現精神沉郁、呼吸急促后，立即給全體山羊使用大觀霉素等藥物進行防治，然而效果不佳。在本次藥物敏感性試驗中可以看出，該病原菌對大觀霉素、氨芐西林等藥物耐藥，而對頭孢曲松高敏，因此，臨床用藥時要進行藥物敏感性試驗，選擇高敏感性藥物進行用藥，不能盲目用藥和濫用藥物。

對于此次病例，由于發病期間處于雨季導致羊舍潮濕，所以易引發本病的發生。因此，羊舍不應該太潮濕。肺炎克雷伯氏菌病的治療原則是及時發現、盡早治療，一旦發現病羊要及時隔離，防止將該病傳染給其他綿羊。另外，需要選擇敏感性藥物頭孢曲松進行用藥治療，對其飼料要添加礦物質等進行飼喂優質性草料。經過一周的治療，病情得到控制。

參考文獻：

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[2]王秀坤,王克軍,孫宇.絨山羊肺炎克雷伯氏菌病的診斷與治療報告[J].現代畜牧獸醫,2013(4):33-34.

[3]康燕菲,田平芳,譚天偉.肺炎克雷伯氏菌毒力因子的研究進展[J].微生物學報,2015,55(10):1245-1252.

[4]許惠.肉牛肺炎克雷伯氏菌的診治報告[J].中國奶牛,2012(14):42-43.

[5]劉海林.豬源肺炎克雷伯氏菌分離株耐藥性調查及防控技術研究[D].江蘇南京,南京農業大學,2015.

[6]楊艷林,陳峙峰,王成福,等.水貂肺炎克雷伯氏菌的分離鑒定[J].特產研究,2012(4):10-12.

[7]郭桂英,李祥,黎丹,等.蟒蛇肺炎克雷伯氏菌的分離與鑒定[J].熱帶生物學報,2013,4(4):332-346.

[8]盧玉婷,鄭丹丹,胡揚揚,等.鯉魚肺炎克雷伯氏菌分離與鑒定[J].中國獸藥雜志,2014,48(9):9-13.

附表 藥物敏感性試驗結果 （單位：mm）