雨生紅球藻ZL-1生長和蝦青素積累條件優化

李艷國, 楊柳, 徐年軍, 孫雪, 張琳

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雨生紅球藻ZL-1生長和蝦青素積累條件優化

李艷國, 楊柳, 徐年軍, 孫雪, 張琳*

寧波大學海洋學院, 浙江省海洋生物工程重點實驗室, 寧波 15211

分離鑒定了一株雨生紅球藻ZL-1, 比較了不同接種密度和吲哚乙酸濃度對其生長的影響; 在此基礎上, 探究了不同濃度水楊酸和鹽度對雨生紅球藻蝦青素積累的影響。結果表明: (1)接種密度為2.00×104cell·mL–1時, 雨生紅球藻生長快速, 最終生物量達到最大值0.43 g·L–1; 不動細胞比游動細胞更快的積累蝦青素, 高光誘導不動細胞得到最高蝦青素產量為8.44 mg·L–1; IAA終濃度為1.5 mg·L–1時, 雨生紅球藻生長速度最快, 最終細胞密度和干重分別比對照組提高了24.28%和27.11%; (2)水楊酸具有緩解高光脅迫和促進蝦青素積累的雙重作用, 15和25 mg·L–1水楊酸誘導下, 雨生紅球藻生物量較高, 蝦青素產量分別比對照組提高了18.18%和18.94%; 使用4‰的鹽度脅迫雨生紅球藻, 蝦青素產量較對照組提高了17.42%, 但鹽度也會引起藻細胞的漂白、死亡, 導致生物量顯著降低。

雨生紅球藻; 接種密度; IAA; 水楊酸; 鹽度; 蝦青素

1 前言

蝦青素(Astaxanthin)屬于類胡蘿卜素類物質, 它不僅是抗氧化活性最高的天然產物, 還是優良的天然著色劑[1]。蝦青素在醫藥、食品保健、化妝品等行業已得到廣泛應用; 亦用作觀賞魚、蝦等經濟水產動物的飼料添加劑[2-3]。雨生紅球藻()是一種淡水單細胞綠藻, 因富含蝦青素而被稱為天然蝦青素的“濃縮品”, 是天然蝦青素最理想的來源之一[4]。雨生紅球藻生產蝦青素多采用兩步培養法：首先優化培養條件以獲得較高的生物量; 然后利用高光等脅迫條件, 誘導蝦青素快速積累。

接種密度是影響微藻增殖速率和最終生物量的重要因素[5-6], 確定合適的接種密度是養殖雨生紅球藻的基礎。吲哚乙酸(IAA)分布廣泛, 具有促進細胞分裂、增殖等作用[7]。研究表明, 適宜濃度IAA能促進藻類細胞增殖, 影響其生化組成[8, 9]。據報道, 水楊酸參與雨生紅球藻蝦青素合成的信號調控, 適宜濃度水楊酸可提高雨生紅球藻類胡蘿卜素基因的表達量[10], 增加其抗氧化活性和蝦青素的積累量[10, 11]。鹽度脅迫也可誘導雨生紅球藻類胡蘿卜素基因的表達[13, 14], 促進蝦青素快速積累[15, 16]。蔣霞敏等[17]研究表明, 在促進雨生紅球藻蝦青素積累的方法中, 鹽度脅迫要優于溫度和光照。李曉夢等[18]使用乙酸鈉調節鹽度, 表明鹽度脅迫比高光更能有效地促進蝦青素積累, 但不同培養條件及藻種所需的最適鹽度不同。本研究優化了促進雨生紅球藻ZL-1生長的最適接種密度及最適IAA濃度, 并在此基礎上探究了雨生紅球藻ZL-1對水楊酸誘導和鹽度脅迫的響應情況, 為雨生紅球藻ZL-1藻株的研究及規模化養殖奠定基礎。

2 材料與方法

2.1 藻種分離、鑒定及培養條件

雨生紅球藻藻種由寧波大學微藻種質庫提供。經多次平板純化后挑取單克隆, 利用抗生素除菌得到純種雨生紅球藻。離心收集生長旺盛的藻細胞, 提取基因組DNA, 利用引物(Forward:5'-ACCTGG-TTGATCCTGCCAG-3'; Recverse:5'-CCTTGTTAC-GACTTCTCCTTCCTCT-3')擴增序列并測序, 將擴增序列與NCBI數據庫進行比對分析, 使用MEGA 7.0構建分子進化樹, 結合藻細胞形態特征, 鑒定藻種。

經篩選, 使用NMB3#[19]作為基礎培養基, 高壓滅菌后使用。使用光照培養箱培養雨生紅球藻, 培養溫度為24 ℃, 光暗比為12 h:12 h, 光照強度為30 μmol·m–2·s–1。每天搖瓶數次, 保證受光均勻。

2.2 實驗設計

2.2.1 接種密度

以對數生長期的雨生紅球藻為接種原液(細胞密度為4×104cell·mL–1), 分別取10 mL、25 mL、50 mL、75 mL和100 mL原液至新鮮培養基, 至終體積均為150 mL, 最終接種密度分別為0.27、0.67、1.33、2.00、2.67×104cell·mL–1, 培養期間監測藻細胞形態及密度變化。培養13 d后, 轉移藻液至70 μmol·m–2·s–1光強下誘導20 d, 收集藻液測定最終干重和蝦青素含量。

2.2.2 吲哚乙酸濃度

將對數生長期的雨生紅球藻接種至新鮮培養基中, 接種密度為2.00×104cell·mL–1, 終體積為150 mL。分別添加IAA至終濃度為：0、0.1、0.5、1、1.5、2.5和5 mg·L–1。藻液共培養13 d, 培養期間監測藻細胞形態及密度變化。

2.2.3 水楊酸誘導及鹽度脅迫

將對數生長期的雨生紅球藻接種至新鮮培養基中, 接種密度為2.00×104cell·mL–1, 終體積為150 mL, 添加IAA至終濃度為1.5 mg·L–1。培養13 d后, 分別進行水楊酸誘導及鹽度脅迫實驗, 實驗分別設置水楊酸濃度梯度為0、5、15、25、50 mg·L–1; 使用氯化鈉調節鹽度至0、2、4、6、8‰。誘導同時, 將藻液轉移至70 μmol·m–2·s–1光強下, 培養期間觀察藻液顏色及細胞形態變化, 誘導5 d后測定最終干重及蝦青素含量。

2.3 生長指標測定

使用浮游生物計數框測定雨生紅球藻細胞密度; 藻液經離心、冷凍干燥后稱重, 并計算干重; 細胞形態使用400倍光學顯微鏡觀察。

2.4 蝦青素含量測定

蝦青素含量測定根據Boussiba等[20]方法改進：移取10 mL藻液(V), 8000 r·min-1離心5 min收集藻細胞, 加入3 mL CH3OH/KOH溶液(30% CH3OH和5% KOH混合液), 渦旋混勻后置于70 °C恒溫水浴鍋中溫浴5 min, 8000 r·min-1離心5 min, 除去上清液; 加入3 mL含少量冰醋酸的二甲基亞砜(DMSO), 70 ℃溫浴5 min, 離心收集上清液即為蝦青素溶液; 重復提取, 直到藻渣透明為止。使用DMSO將蝦青素溶液定容至體積V, 492 nm波長下測定吸光度A。

計算雨生紅球藻蝦青素含量C(mg·L–1):

公式中：V為藻液體積;V為提取液體積;A為吸光度值。

2.5 數據分析

所有實驗均設置三組平行, 實驗數據使用one-way ANOVA進行差異顯著性分析(＜0.05), 采用Duncan test進行多重比較并分析組間差異, 數據采用平均值±標準差(mean±SD)的形式表示。

3 結果與討論

3.1 雨生紅球藻的鑒定及進化分析

PCR擴增得到序列, 與NCBI數據庫比對后, 使用最大似然法(Maximum Likelihood Method)構建分子進化樹。如圖1所示, 本藻株ZL-1與其他兩株親緣關系最近。藻株ZL-1在游動細胞階段時, 藻細胞近似球形或橢圓形, 具有兩條鞭毛, 細胞壁與原生質體分離形成明顯的周質空間, 并有輻射狀原生質絲貫穿其中。在高光誘導下, 藻細胞鞭毛脫落, 細胞內部逐漸出現微紅色或橘色, 僅極少數細胞仍進行增殖, 表明游動細胞轉化為不動細胞, 并開始積累蝦青素; 隨著誘導時間的增加, 細胞體積逐漸增大, 細胞壁明顯加厚, 細胞內部紅色不斷加深(蝦青素積累), 最終充滿整個細胞, 以上形態特征與莊惠如等[21]描述的雨生紅球藻超微結構類似。綜上所述, 確定ZL-1為雨生紅球藻, 命名為ZL-1。

3.2 接種密度對雨生紅球藻生長及蝦青素產量的影響

不同接種密度下, 雨生紅球藻的生長曲線如圖2所示。接種密度為2.67×104cell·mL–1的組分在前9 d始終保持較高的細胞密度, 隨后則進入平穩期; 顯微觀察發現, 9 d后細胞鞭毛逐漸脫落, 游動細胞逐漸轉為不動細胞, 藻細胞出現下沉、聚集現象。在整個培養過程中, 接種密度為0.27、0.67、1.33、2.00×104cell·mL–1的組分藻液狀態均一, 細胞密度持續增長; 培養至第13 d, 2.00×104cell·mL–1的組分細胞密度高于其他組分, 達到26.52×104cell·mL–1, 藻細胞仍處于游動細胞期。結果表明：接種密度較低細胞密度增長緩慢, 較高則會縮短對數生長期, 2.00×104cell·mL–1為最佳接種密度。沈淵等[22]使用20 L光生物反應器通氣培養雨生紅球藻, 結果表明, 最佳接種濃度為2.3×104cell·mL–1, 最高細胞密度為30.40×104cell·mL–1。WANG等[6]使用3.6 L氣升式光生物反應器培養雨生紅球藻, 其接種密度為2.00×104cell·mL–1, 效果良好。本研究中, 培養體積雖遠低于光生物反應器, 但最佳接種密度(2.00×104cell·mL–1)與之相近, 表明雨生紅球藻在不同培養體積下, 具有相近的最佳接種密度。

圖1 雨生紅球藻ZL-1分子進化樹(最大似然法)

高光誘導處理后最終生物量及蝦青素含量如表2所示。接種密度為2.00×104cell·mL–1的組分最終生物量達到最大0.43 g·L–1, 2.67×104cell·mL–1次之, 兩組無顯著差異。高光誘導時, 接種密度為2.67×104cell·mL–1的組分處于不動細胞期, 誘導20 d后, 其蝦青素產量達到最大值8.44±0.32 mg·L–1, 但與接種密度為2.00×104cell·mL–1的組分無顯著差異, 而兩組蝦青素占干重比例差異顯著。結果表明, 蝦青素產量不僅與生物量、誘導時間有關, 還與誘導之初藻細胞的狀態有關, 不動細胞比游動細胞更快的積累蝦青素。與大多研究者相同, 本研究選擇對數生長期的藻細胞作為研究對象, 此時細胞處于游動細胞期, 細胞狀態最佳, 具代表性, 但抗逆性較弱[10–15]。在大規模養殖過程中, 若選擇處于不動細胞期的雨生紅球藻作為誘導對象, 有利于減少生物量的損失, 促進蝦青素快速積累, 縮短誘導時間。LV等[23]在研究中使用80 μmol·m–2·s–1的光強誘導處于游動細胞期的雨生紅球藻, 21 d后蝦青素含量約占干重1.2%, 低于本研究結果, 表明本藻種具有較好的應用潛力。

3.3 吲哚乙酸對雨生紅球藻生長的影響

本研究表明IAA對雨生紅球藻ZL-1的生長促進效果顯著, 結果如圖3、圖4所示。隨著IAA濃度的升高, 細胞密度和干重均呈現先升高后降低的趨勢, IAA濃度為1.5 mg·L–1時效果最好, 其細胞密度始終保持最大, 最終干重也高于其他濃度處理, 與對照組相比, 分別提高了24.28%和27.11%; 超過適宜濃度后, IAA對雨生紅球藻的生長不利, 當IAA達到5 mg·L–1時, 藻細胞基本處于停滯生長的狀態。IAA具有調節微藻生長代謝的作用。有研究表明, 0.1—0.5 mg·L–1IAA可促進微擬球藻生長, 繼續提高IAA濃度則產生抑制效果[8]; 同樣, 在小球藻[24]、紫菜[25]等的研究中, IAA對生長代謝的影響均呈現低濃度促進、高濃度抑制的特點。本研究表明, 1.5 mg·L–1IAA對雨生紅球藻的生長促進效果最佳, 過高濃度則產生抑制作用, 與IAA對其他微藻的作用相同。IAA憑借其成本低、微量高效等特性, 在微藻規模化養殖中具有重要應用價值。

圖2 不同接種密度下雨生紅球藻的生長曲線

表1 不同接種密度下雨生紅球藻的生物量及蝦青素產量

圖3 不同濃度IAA處理下雨生紅球藻的生長曲線

圖4 不同濃度IAA作用下雨生紅球藻的最終生物量

3.4 水楊酸對雨生紅球藻生物量及蝦青素產量的影響

水楊酸誘導3 d后藻液呈現不同程度的黃綠色, 顯微觀察發現細胞多處于不動狀態, 胞漿微紅; 培養5 d后, 藻液顏色變化更加明顯, 周質空間基本消失, 細胞壁有所加厚。5 d后收集藻細胞測定干重及蝦青素產量。結果如表3所示, 誘導5 d后, 對照組生物量低于3.3部分的處理結果, 表明高光導致雨生紅球藻生物量下降[26]。隨著水楊酸濃度升高, 生物量呈先上升后下降的趨勢, 15 mg·L–1時達到最大值, 推測適宜濃度水楊酸可誘導細胞增強抗逆能力[27, 28], 從而緩解了高光對雨生紅球藻的脅迫作用, 但水楊酸濃度過高時效果下降。

水楊酸具有誘導β-胡蘿卜素酮化酶(bkt基因表達的作用[29], GAO等[10, 30]使用熒光定量PCR及比較轉錄組學技術分析了25 mg·L–1水楊酸對雨生紅球藻基因表達的影響, 表明水楊酸可提高蝦青素合成相關基因的表達, 推測水楊酸參與蝦青素合成過程的信號調控。本研究發現, 水楊酸處理組蝦青素產量均高于對照組, 即適宜濃度水楊酸可誘導蝦青素積累。當水楊酸濃度為15和25 mg·L–1時, 蝦青素產量最高, 分別達到3.12±0.02和3.14±0.10 mg·L–1, 較對照組提高了18.18%和18.94%; 當水楊酸濃度為50 mg·L–1時, 蝦青素產量下降, 表現出低濃度促進高濃度抑制的雙重作用。李梓楠等[12]研究表明, 12 mg·L–1水楊酸可顯著促進蝦青素合成, 但未做更高濃度的研究(>12 mg·L–1); 本研究擴大了水楊酸的濃度范圍, 表明15—25 mg·L–1水楊酸誘導蝦青素積累效果最佳, 實際養殖中使用15 mg·L–1水楊酸即可得到較高生物量和蝦青素產量, 節省成本。

3.5 鹽度對雨生紅球藻生物量及蝦青素產量的影響

培養3 d后, 鹽度處理組藻液顏色明顯轉變, 鹽度越高變化越明顯。顯微觀察發現, 除對照組外, 各處理組均出現不同程度的藻細胞漂白、死亡現象, 鹽度為8‰時最為嚴重。最終干重及蝦青素產量如表4所示, 隨著鹽度升高, 生物量顯著下降; 蝦青素產量則呈先上升后下降的趨勢, 在鹽度為4‰時, 蝦青素產量達到最大值3.10 mg·L–1, 較對照組提高了17.42%。

雨生紅球藻是淡水微藻, 施加鹽度會增加細胞滲透壓, 影響其生長及代謝。GAO等[14]使用10‰的鹽度和50 μmol·m–2·s–1光照處理三株雨生紅球藻, 10 d后蝦青素占干重比例最高為1.77%, 蝦青素合成相關基因表達量上調, 該研究也發現鹽度脅迫會造成藻細胞大量漂白、死亡。李曉夢等[18]使用乙酸鈉調節鹽度至2%, 發現鹽脅迫能有效地促進蝦青素積累, 但蝦青素積累量僅為1.33 mg·L–1。Vidhya-vathi等[31]使用營養脅迫、17 mM氯化鈉、4.4 mM乙酸鈉和60 μmol·m–2·s–1光照共同誘導雨生紅球藻蝦青素積累, 6 d后蝦青素占干重比例2.45%,表明鹽度與其他誘導條件結合效果更佳。本研究結果表明, 4‰鹽度誘導效果最好, 所得到的蝦青素產量較高, 但也會導致生物量的減少, 今后還應探索鹽度脅迫與其他誘導條件相結合, 以降低氯化鈉的使用, 使之既能維持較高的生物量, 又能促進蝦青素快速積累。

表2 水楊酸對雨生紅球藻最終干重及蝦青素產量的影響

表3 鹽度對雨生紅球藻最終干重及蝦青素產量的影響

4 結論

隨著醫療保健、水產養殖等行業的快速發展, 蝦青素的市場需求日益增加, 利用雨生紅球藻生產蝦青素一直是研究的熱點, 但因藻種、培養及誘導方法的不同, 仍有很多問題亟待解決。本研究分離鑒定了一株雨生紅球藻ZL-1, 研究發現接種密度為2.00×104cell·mL–1能夠保持細胞旺盛生長, 提高生物量; 相同誘導條件下, 不動細胞比游動細胞更快的積累蝦青素, 適合大規模養殖時作為誘導對象。IAA濃度為1.5 mg·L–1時, 雨生紅球藻生長速度最快, 最終細胞密度和干重都有大幅提高, 而過高濃度IAA則產生抑制作用。15和25 mg·L–1的水楊酸及4‰的鹽度均可顯著提高蝦青素的產量, 但水楊酸還具有緩解脅迫的作用, 鹽度處理則導致細胞大量漂白、死亡, 生物量顯著降低。本藻株在優化的細胞密度和IAA濃度下可快速生長, 在高光條件下, 水楊酸和鹽度可促進蝦青素快速積累, 具有一定的應用潛力, 后續研究將進一步研究雨生紅球藻高密度養殖技術和促進雨生紅球藻蝦青素快速積累的方法。

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Optimization of growth and astaxanthin accumulation ofZL-1

LI Yanguo, YANG Liu, XU Nianjun, SUN Xue, ZHANG Lin*

School of Marine Sciences,Key Laboratory of Marine Biotechnology, Ningbo University, Ningbo 315211, China

has received much attention as its high astaxanthin content under various stress conditions. Anovel strainZL-1wasisolated and identified; the effect of initial density and indole-3-acetic acid(IAA) on growth ofwas explored; then, salicylic acid and salinity were used to induce astaxanthin accumulation. Results showed that the final biomass with initial density of 2.00×104cell·mL–1was the largest(0.43 g·L–1).The accumulation of astaxanthin in non-motile cells which reached up to 8.44 mg·L–1, higher than that of the motile cells. IAA with the final concentration of 1.5 mg·L–1played the most significant role in promotinggrowth,and the cell concentration and dry weight were respectively improved by 24.28% and 27.11% compared with the control. Salicylic acid had the dual effects of alleviating high light stress and inducing the accumulation of astaxanthin. The biomass of groups with 15 mg·L–1and 25 mg·L–1salicylic acid was higher than others, and the astaxanthin yields were improved by 18.18% and 18.94% respectively than the control group. The proper salinity to induce astaxanthin was 4‰, which improved the astaxanthin yield by 17.42%.However, salinity could lead to bleach and death of algal cells, resulting in a significant decrease in biomass.

;initial density; indole-3-acetic acid; salicylic acid; salinity; astaxanthin

Q945.78

A

1008-8873(2018)01-020-07

2017-03-16;

2017-06-13

國家自然科學基金(31572638); 浙江省科技廳公益性項目(2015C32021); 寧波市自然科學基金項目(2015A610265); 寧波市科技計劃項目(2014C10023); 寧波大學學科項目(xkl1526); 浙江省新苗人才計劃(2016R405078)

李艷國(1992—), 男,河南三門峽人, 研究生, 主要從事藻類生物學研究, E-mail: 807573212@qq.com

張琳(1985—), 女, 博士, 講師, 主要從事藻類分子生物學研究, E-mail:315308497@qq.com

10.14108/j.cnki.1008-8873.2018.01.003

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