海灣扇貝碳氮穩定同位素的分餾系數和轉化率研究

王 震，田甲申，李多慧，韓羽嘉，鹿志創，傅志宇，木云雷

(1.大連海洋大學 水產學院，遼寧 大連 116023；2.遼寧省海洋水產科學研究院，遼寧 大連 116023；3.大連市水產研究所，遼寧 大連 116019)

穩定同位素技術反映了被消費者吸收利用的較長一段時間的食物信息，已被廣泛應用于食物網有機物傳遞過程、評估各種食物對捕食者生長貢獻度的研究中[1]。確定生物體內穩定同位素的分餾系數和轉化率，是穩定同位素技術應用于食物網研究的前提和基礎[2]。

分餾系數是估算食物對消費者貢獻度、判斷消費者營養級的關鍵數據。早期研究表明，捕食者新陳代謝傾向于利用較輕元素，而富集較重元素，從而產生動物與食物之間的分餾效應[3-4]，且動物與食物之間的穩定同位素值存在較為確定的判別值，如Δδ13C:0‰～1.0‰,Δδ15N:3.0‰～ 4.0‰[5-6]，這是穩定同位素技術得以廣泛應用的前提。然而，Deniro等[3]在研究食物對不同物種的C同位素影響時，發現各物種分餾系數的平均值為0.8‰，但種間變化較大(0.6‰～2.7‰)。因此，分餾系數的研究備受關注。Roth等[7]研究發現，紅狐(Vulpesvulpes)體內血清對食物的Δδ15N值達4.2‰，而肝、肌肉和毛皮為3.3‰～3.5‰。Gamboa-Delgado等[8]通過室內飼喂試驗,發現凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)肌肉組織中Δδ15N值與飼料中蛋白質含量有關。應用穩定同位素技術研究食物網結構時，若忽略C、N穩定同位素的分餾系數變化，則很可能產生對食物網結構的錯誤構建[9-10]。

同位素轉化率代表各組織穩定同位素值(動物吸收的食物)的時間尺度。研究發現，變溫動物[11-12]和恒溫動物[12-13]的穩定同位素轉化率均存在物種特異性和組織特異性。Dubois等[2]在研究太平洋牡蠣(Crassostreagigas)和紫貽貝(Mytilusedulis)的穩定同位素轉化率時，發現兩種貝類的N同位素半衰期(14.5 d)大約是C同位素半衰期(8.5 d)的兩倍；Guelinckx等[14]發現刺鰭魚(Pomatoschistusminutus)新陳代謝快的組織(肝臟、心臟)穩定穩定同位素半衰期，短于新陳代謝慢的肌肉組織，即不同組織的同位素值反映出不同時間尺度動物的食物特征。因此，若要提高穩定同位素在研究食物網時的準確性、精確性，需通過更多室內喂養控制試驗來獲取不同物種不同組織的穩定同位素分餾系數和轉化率。

目前，國內穩定同位素技術在生態系統中的應用多集中于野外研究，如潮間帶、近海的食物網構建[15-16]，魚類、刺參等的食物組成等[17-19]。近幾年，國內學者已對錦鯉(Cyprinuscarpio)、軍曹魚(Rachycentroncanadum)、黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[20-22]的穩定同位素分餾系數和轉化率進行了研究，而有關海灣扇貝(Argopectenirradias)穩定同位素分餾系數和和轉化率的研究尚未見報道。海灣扇貝原產于美國大西洋沿岸，1982年引種到我國，具有生長速度快、養殖周期短、營養價值高等特點，現已成為我國主要養殖經濟貝類之一。以海灣扇貝為研究對象，通過室內控制試驗，研究海灣扇貝不同組織C、N穩定同位素的分餾系數和轉化率，旨在為利用穩定同位素技術研究海灣扇貝等貝類在促熟期的餌料貢獻率、在自然海域時的餌料來源奠定基礎，同時也為海洋食物網的科學構建、穩定同位素技術更加科學的應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

采集大連大李家海域同齡海灣扇貝，按大小分為兩類，體質量和殼高分別為：大規格，(30.23±3.25) g和(57.12±2.00) mm，小規格，(19.06±3.12) g和(49.03±2.13) mm。螺旋藻粉購自山東東營康瑞科技開發有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計和日常管理

試驗開始前，將海灣扇貝表面附著物沖洗干凈，挑選健康個體暫養于容積為2 m3的玻璃鋼水槽內。試驗開始后，設置試驗組和對照組各1個，每組3個平行，共6個玻璃鋼水槽，每槽放海灣扇貝大、小規格各60枚。試驗期間每日倒池1次，持續充氧，水源為沙濾沉淀海水，水溫為14.50～15.50 ℃、溶解氧為9.91～10.81 mg/L、pH為7.87～8.04，鹽度33.92～34.16。試驗周期74 d，前14 d不投餌，以使扇貝充分適應環境，并處于活力較好的狀態；自第15 d開始，倒池后向試驗組投喂螺旋藻粉，投喂前用400目篩絹網過濾，投喂密度7 mg/(L·d)，對照組不投餌。

1.2.2 樣品處理

將第14 d設為第0 d，分別在第0、4、8、12、16、20、28、36、44、52 d和60 d每槽各取3枚扇貝，取其肝胰腺、性腺、閉殼肌組織，用去離子水清洗干凈，60 ℃烘干24 h，用瑪瑙研缽研磨成粉末，經100目篩絹網過濾，同時取螺旋藻粉，用于δ15N和δ13C值的測定。

1.2.3 碳氮穩定同位素的測定

所有樣品于遼寧省海洋水產科學研究院穩定同位素實驗室進行測定。穩定同位素質譜儀為菲尼根Flash 2000 HT型元素分析儀和菲尼根Delta V Advantage同位素比率質譜儀相連而成。δ13C值以PDB為參考標準，δ15N值以大氣氮為參考標準。為保證結果準確性，同一樣品的碳、氮穩定同位素分別進行測定。每個樣品測定3個平行樣，為保持試驗結果的準確性和儀器的穩定性，每測定5個樣品后插測1個標準樣，δ15N和δ13C值精密度<±0.15‰。

1.2.4 指標計算

應用指數衰減曲線對同位素的特征變化與時間進行擬合，分餾系數、扇貝各組織對C或N同位素的半衰期分別見下式：

Y=c+ae(-λt)

DTF =c-b[28]

t1/2=ln(2)/λ[23]。

式中，t為時間，Y為t時各組織的δ13C或δ15N值，c為組織同位素漸進值，a為初始與平衡條件之間的差異，λ為C或N同位素的轉化率，DTF為分餾系數，b為餌料的同位素值，t1/2為半衰期。

1.3 數據處理

研究結果采用平均值±標準差表示。采用SPSS 13.0統計軟件包中的Compare means進行One-way ANOVA分析，差異顯著性用Scheffe和Tukey’s HSD法進行事后多重比較，生長曲線采用SigmaPlot 13.0軟件進行擬合。

2 結 果

2.1 海灣扇貝的生長情況

不同規格海灣扇貝試驗前后殼高、體質量變化見表1。試驗組與對照組的海灣扇貝不同規格殼高、體質量均未發生顯著變化(P>0.05)。

2.2 海灣扇貝各組織的分餾系數

海灣扇貝各組織C、N穩定穩定同位素比值變化見表2。試驗過程中，海灣扇貝大、小規格之間的各組織C、N穩定同位素比值無顯著差異(P>0.05)，試驗前后，對照組各組織的δ13C和δ15N值均未發生顯著變化(P>0.05)；試驗組各組織的δ13C值變化顯著，而δ15N值變化較小。第0 d，肝胰腺與其他兩組織的δ13C值存在顯著差異(P<0.05)，性腺與閉殼肌之間δ13C值無顯著差異(P>0.05)；而三者之間的δ15N值無顯著差異(P>0.05)。此后，試驗組投喂螺旋藻粉(δ13C=-27.83‰; δ15N=7.36‰)。第60 d時，肝胰腺δ13C值變化最顯著，由-18.46‰降至-23.61‰，分餾系數為3.92‰；其次是性腺由-17.32‰降至-19.90‰，分餾系數為7.84‰；閉殼肌的δ13C值變化最小，由-17.76‰降至-18.01‰，且三者之間δ13C值存在極顯著差異(P<0.01)。第60 d時，肝胰腺的δ15N值變化顯著，而性腺和閉殼肌的δ15N值未發生顯著變化(P>0.05)。第44 d～60 d肝胰腺和性腺組織的δ15N值均趨于穩定且高于對照組，因此推斷肝胰腺和性腺組織的Δδ15N值分別為2.15‰、1.84‰。

表1 試驗前后海灣扇貝殼高和體質量的變化情況(n=10)

注：同一列中不同小寫字母表示不同性狀間差異顯著(P<0.05)，同一行中不同大寫字母表示同一性狀不同時間的值差異顯著(P<0.05)；n代表樣本數量.下同.

表2 海灣扇貝各組織C、N穩定同位素值的變化(n=3) ‰

2.3 海灣扇貝各組織的轉化率

海灣扇貝各組織及餌料的C、N穩定同位素值隨時間的變化見圖1。對照組各組織δ13C和δ15N值在1.0‰范圍內波動，未發生顯著變化(P>0.05)，餌料的δ13C和δ15N值在試驗期間變化不顯著(P>0.05)。試驗組海灣扇貝肝胰腺、性腺、閉殼肌的δ13C值與時間擬合曲線的擬合優度(r2)分別為0.99、0.96、0.38(表3)，肝胰腺和性腺的擬合優度良好，閉殼肌的擬合優度較差。肝胰腺和性腺的C穩定同位素轉化率非常接近，半衰期分別為10.88 d和10.22 d，閉殼肌的C穩定同位素轉化率最慢，但由于其與時間擬合曲線的擬合優度較差，不能準確反映出閉殼肌的C穩定同位素半衰期。試驗組各組織的δ15N值無法與時間擬合成指數衰減曲線。第0 d～44 d，試驗組肝胰腺和性腺的δ15N值上下波動，第44 d～60 d相對穩定，且略高于對照組，而閉殼肌的δ15N值與對照組差異最小。由此可推斷，肝胰腺和性腺在第40 d達到穩定同位素平衡，兩組織的N同位素半衰期約為20 d，閉殼肌N同位素半衰期遠大于其他組織。

表3 海灣扇貝各組織δ13C值隨時間的擬合方程及同位素轉化半衰期

3 討 論

3.1 影響動物組織穩定同位素轉化的因素

動物組織穩定同位素組成受動物自身條件(種類、年齡等)與環境因素(食物、理化因素等)的綜合影響。其中，食物的穩定同位素組成是動物組織穩定同位素組成的決定性因素[3,24]。食物的改變，可通過新陳代謝和組織生長兩個過程影響動物組織穩定同位素組成[12,25-27]。Fry等[26]研究發現，當對蝦的體質量增加4倍時，蝦與餌料達到穩定同位素平衡，并利用組織同位素隨組織生長的轉化率模型，證明蝦組織同位素轉化率主要與組織生長有關。這一試驗設計得到廣泛認可，學者們在室內研究貝類穩定同位素轉化率時，多以幼齡貝為研究對象，并應用上述模型得到了相似規律[2,28]。本研究的海灣扇貝均為成熟個體，試驗前后無顯著生長(P>0.05)。因此，本研究中餌料對海灣扇貝各組織同位素組成的影響，主要通過新陳代謝途徑引起。

圖1 海灣扇貝各組織δ13C和δ15N值隨時間的變化注：虛線F1代表Y=c+ ae(-λt)擬合方程曲線；折線F2、C代表試驗期間試驗組、對照組各組織穩定同位素比值變化；折線E代表試驗期間餌料同位素比值變化.

3.2 動物組織C、N穩定同位素的轉化率

動物各組織新陳代謝速率不同，不同組織的同位素值反映了不同時間尺度動物的食物特征。研究表明，恒溫動物和變溫動物不同組織的同位素轉化率均可能出現一定差異[13,20,23,29-30]。試驗結果顯示，海灣扇貝肝胰腺和性腺的同位素轉化率相近，而閉殼肌同位素半衰期遠大于其他組織，這可能與試驗水溫、海灣扇貝的貝齡有關。研究發現，成年寬鼻白鮭(Coregonusnasus)穩定同位素半衰期約為1年[25]，遠大于美洲擬鰈(Pseudopleuronectesamericanus)幼魚半衰期(1～19 d)[31]。溫度對C、N同位素轉化率有顯著影響，13 ℃時，美洲擬鰈幼魚的C、N同位素半衰期分別為(4.1±0.6) d、(3.9±0.7) d；18 ℃時，C、N同位素半衰期分別為(2.2±0.3) d、(3.1±0.3) d[31]。這可能是因為成年動物組織生長和新陳代謝比幼齡動物緩慢，變溫動物的生物化學反應在低溫下會減緩[32]。本研究所用海灣扇貝均為成熟個體，試驗溫度為14.50～15.50 ℃，并非其最適生長溫度(22 ℃)[33]，且閉殼肌在3種組織中代謝最慢,這些可能與閉殼肌需要更長時間才能達到同位素平衡有關。

動物攝食后，食物中的C、N元素會在代謝途徑上發生解偶聯，即C、N元素的代謝傳遞途徑可能發生變化[2]。Hobson等[23]在研究刺嘴鶯(Sylviaborin)血液及羽毛同位素轉化率時，發現C元素的轉化率比N元素轉化率快。Dubois等[2]在研究無脊椎動物時也報道了相似的轉化規律，太平洋牡蠣和紫貽貝C元素新陳代謝速率是N元素的兩倍。本試驗中，肝胰腺和性腺的C元素半衰期約為10 d，根據折線圖推斷出的N元素半衰期接近20 d，同樣驗證了C、N元素在組織代謝過程中轉化速率存在差異。這可能是由于雙殼類儲存物質(如，糖元)的積累，且加快了碳水化合物和脂肪的代謝。

3.3 動物組織C、N穩定同位素的分餾系數

本試驗中，海灣扇貝各組織δ13C值在第60 d時存在極顯著差異，閉殼肌的δ15N值與其他兩組織存在顯著差異。各組織的δ13C值差異可能是由于脂肪含量的不同引起：生命體在合成脂肪的過程中,會發生明顯的碳歧視效應,即趨向于利用較輕的12C合成脂肪,進而脂肪中的δ13C要比蛋白質和單糖類化合物低6‰[34]，而肝胰腺是雙殼貝類脂質的主要貯存器官，脂肪含量高于其他組織[35]。各組織的δ15N值存在差異可能與氨基酸含量差異、不同組織代謝途徑存在差異有關。同時，本研究為保證餌料δ13C和δ15N值的穩定性，試驗組只投喂螺旋藻粉，這可能會導致海灣扇貝餌料過于單一。海灣扇貝不同組織對營養物質的需求不同，若餌料不能滿足各組織的營養需求就會造成生物體營養不良。當生物體營養不良時，它會通過提高攝食量來彌補不足，這就導致各組織的分餾系數差異越來越大。

本研究選取年齡相同、大小不同的海灣扇貝，用于研究二者C、N穩定同位素轉化及分餾是否存在差異，并探討二者的生長差異是否與穩定同位素轉化快慢有關。結果顯示，海灣扇貝不同規格的C、N同位素轉化率和分餾系數均無顯著差異(P>0.05)。這可能與試驗溫度較低有關，在低溫時大、小規格代謝水平都比較低，不存在顯著差異。海灣扇貝不同規格的分餾系數與殼高無關，這與Herzka等[27]在研究幼魚對食物的分餾時，發現分餾系數與美洲擬鰈自身大小無關相一致。本研究中海灣扇貝的穩定同位素分餾系數超出了被普遍接受的范圍，這也驗證了在利用穩定同位素技術研究食物網結構、餌料貢獻率時，需充分考慮分餾系數變化所帶來的影響，需謹慎引用經驗值。

3.4 問題與展望

螺旋藻粉是海灣扇貝的一種代餌，可能無法滿足扇貝的生長需求。同時，螺旋藻粉與試驗對象之間δ15N值接近，無法清晰顯示出海灣扇貝N元素隨時間的變化情況。另外，試驗水溫較低，并不是試驗對象的最適生長溫度，這可能是造成閉殼肌在試驗過程中未達到同位素平衡的主要原因。在今后的實驗室研究中，需注意：(1)食物的選擇。在保證食物單一且具有穩定的同位素比值前提下，食物與試驗動物之間的同位素比值要有一定差異，并且餌料營養需均衡，以減少營養不良等因素對試驗的影響。(2) 溫度等影響新陳代謝因素的設定。不同溫度對試驗動物同位素轉化率及分餾系數的影響是否存在顯著差異；溫度在何時，室內試驗數據才能準確反映野外動物的同位素轉化率及分餾系數，均有待進一步研究。(3) 試驗對象的選擇。受組織生長影響較大的低齡動物與食物之間更易達到同位素平衡，為獲得較好的試驗數據，大多數研究均選取低齡動物為研究對象。但在構建自然生態系統食物網時會涉及不同年齡的動物，同種動物不同年齡之間的同位素轉化率及分餾系數是否存在顯著差異，仍有待進一步研究。雖然穩定同位素技術已成為研究動物食物源與營養關系的重要手段，但仍需通過更多室內喂養控制試驗來提高穩定同位素在研究食物網時的準確性、精確性。

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