響應面法優化鹽堿土中所得一株細菌的培養條件

曹 禮，張學虹，趙惠蓉，孫銘悅，張 艷，張曉梅，張 耐，李得芳

（1.河西學院 農業與生物技術學院，甘肅 張掖 734000；2.河西學院 甘肅省河西走廊特色資源利用重點實驗室，甘肅 張掖 734000）

土壤鹽漬化是21世紀人類面臨的十分突出的問題，全球鹽漬化土地以每年（1.0～1.5）×106hm2的速度在增長[1]。土壤鹽漬化直接危害農作物生長，導致農業減產，降低土地生產力，嚴重影響和限制現有土壤資源利用和現代農業發展[2]，是世界上許多干旱和半干旱地區農業產量下降的主要原因[3-4]。鹽漬化土地在全球范圍分布廣泛，由于其土壤質量差、作物產量低，已成為土壤退化中的世界性難題[5]。我國西部地區屬于干旱和半干旱地區，由于自然和人為因素的作用，鹽漬化土地面積逐年增加，鹽漬化程度不斷加深，已嚴重影響到國民經濟、社會發展和生態環境的可持續發展[6-7]。

土壤微生物在物質循環、能量流動和信息傳遞等方面發揮著重要作用，它們在土壤中的分布特征反映了植物營養與土壤肥力狀況之間的關系[8]。微生物種群結構的多樣性、穩定性和種群恢復性在維護土壤生態系統的有效性中起著關鍵作用[9-10]。土壤微生物和地上植被是相輔相成、不可分割的整體，它們互相影響、互相制約，為生態系統的多樣性和穩定性提供有利條件[11]。土壤微生物數量及微生物多樣性可以作為鹽漬化土壤質量恢復及評價的生物指標[12]。改良與開發鹽漬化土地以及防治土壤的次生漬化，己成為實現土地資源可持續利用和農業可持續發展的一個重要方面[13]。本研究以張掖鹽漬化土壤中篩選得到的菌株HX-6作為研究對象，在單因素試驗的基礎上，通過響應面分析探討菌株HX-6的最適生長條件，以期為鹽漬化土壤的修復提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

節桿菌（Arthrobactersp.）HX-6：從甘肅張掖鹽漬化土壤中篩選所得，實驗室保藏；試驗中所用到的試劑均為分析純，購自上海生工生物工程有限公司。

LB培養基：酵母粉5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，氯化鈉8.0 g/L，pH 7.0；

無氯化鈉LB培養基：酵母粉5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，pH 7.0。固體培養基在上述培養基基礎上加入瓊脂粉，使其質量濃度為15 g/L。

1.2 儀器與設備

YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；HZQ-X400恒溫振蕩培養箱：太倉市華美生化儀器廠；SWCJ-1超凈工作臺：蘇州凈化設備；FA2004B電子分析天平：上海天平儀器廠；SC-02離心機：上海安亭科學儀器廠；722s分光光度計：上海精密科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的培養和種子液的制備

將-70℃冷凍保藏的菌株HX-6劃線接種于LB固體培養基上，30℃培養過夜。挑取單菌落接種于5 mL LB液體培養基中，于30℃、150 r/min培養至對數生長期后期，6 000 r/min離心10 min收集菌體，用無菌水洗滌2次，加入無菌水重新懸浮菌體，調節OD600nm值至1.5，作為種子液，按體積分數3%的接種量將種子液接入相應的培養基中。

1.3.2 不同pH對菌株HX-6生長的影響

培養液中pH值的維持使用不同的液體緩沖液體系，以測定不同pH值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0）對菌株HX-6生長的影響。當pH值為5.0～8.5時，選擇用磷酸鹽緩沖體系；當pH值為9.0時，選擇用碳酸鹽緩沖體系。試驗中20 mL培養基含18 mL的緩沖液體系和2 mL LB液體培養基，將種子液以體積分數3%的接種量接種到液體培養基中，30℃、150 r/min培養72 h，在波長600 nm處測其吸光度值（即OD600nm）。每個試驗設置3個平行試驗，設不接種任何微生物的樣品為空白對照，最終數值為3個平行數值的平均值，下同。

1.3.3 不同培養溫度對菌株HX-6生長的影響

配制液體LB培養基至錐形瓶，滅菌后將種子液以體積分數3%的接種量接入其中，在不同的溫度（20℃、25℃、30℃、35℃、40℃）條件下，150r/min培養22h，在波長600nm處測其吸光度值。

1.3.4 不同氯化鈉含量對菌株HX-6生長的影響

錐形瓶中加入液體無氯化鈉的LB培養基，分別加入氯化鈉，使其最終含量分別為0、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.0%、5.0%、10.0%，滅菌，然后將種子液以體積分數3%的接種量接種其中，30℃、150 r/min培養12 h，在波長600 nm處測其吸光度值。

1.3.5 響應面試驗設計

根據單因素試驗結果及Box-Behnken設計原則，3個因素分別以A（pH），B（培養溫度）和C（氯化鈉含量）表示。以單因素試驗結果的最適條件作為中水平，即0水平[14]，試驗設計中所用的因素與水平見表1。

2 結果與分析

2.1 不同pH對菌株HX-6生長的影響

由圖1可知，菌株HX-6在pH值為6.0～7.0范圍內生長良好，當pH為7.0時，菌株HX-6的生長最好，此時菌懸液OD600nm值最大，為0.76；當pH為＜5.5或＞8.0時，菌株HX-6的生長量較低，生長受到嚴重抑制。因此，菌株HX-6的最適生長pH為7.0。

圖1 不同pH對菌株HX-6生長的影響Fig.1 Effects of different pH on the growth of strain HX-6

2.2 不同培養溫度對菌株HX-6生長的影響

由圖2可知，不同的培養溫度下，菌株HX-6的生長差異顯著。菌株HX-6在30～35℃的范圍內生長較好，其中35℃生長最好，此時OD600nm最大為0.46；在培養溫度高于40℃或低于25℃條件下生長量較低，均影響菌株HX-6的生長。因此，菌株HX-6的最適培養溫度為35℃。

圖2 不同培養溫度對菌株HX-6生長的影響Fig.2 Effects of different culture temperature on the growth of strain HX-6

表1 菌株HX-6培養條件優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for strain HX-6 culture conditions optimization

2.3 不同氯化鈉含量對菌株HX-6生長的影響

由圖3可知，氯化鈉含量較低時對菌株HX-6生長有明顯的促進作用，當氯化鈉含量為0.1%～0.5%時，相對于不加氯化鈉的培養環境，培養相同時間后菌株HX-6生長量（OD600nm值）有所增加。當氯化鈉含量為0.5%時菌株HX-6生長量最大，OD600nm值為1.56；當LB培養基中氯化鈉質量分數＞1%時，菌株HX-6的生長明顯被抑制，但當LB培養基中NaCl含量為10%時，菌株HX-6依然可以生長，在相同培養時間生長量較低，這說明菌株HX-6最適生長的氯化鈉含量為0.5%，但可以耐受培養基中含量為10%的NaCl。

圖3 不同氯化鈉含量對菌株HX-6生長的影響Fig.3 Effects of different sodium chloride concentration on the growth of strain HX-6

2.4 響應面分析

根據Box-Behnken設計原則和單因素試驗的結果，以A（pH）、B（溫度）、C（氯化鈉質量分數）為主要考察因素，進行響應面試驗設計，150r/min振蕩培養11h后，以波長600nm處細菌懸液的吸光度值（Y）為考察指標，設計3因素3水平（共17個試驗點，6個中心點）的響應面試驗[15]，每組試驗重復3次，取其平均值，試驗設計情況及其結果如表2所示。

表2 菌株HX-6培養條件優化響應面試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for strain HX-6 culture conditions optimization

經過擬合后得到菌株的生長量（OD600nm值）關于三個考察因素（pH、溫度和氯化鈉質量分數）的回歸方程為：

本研究在Box-Behnken試驗設計中涉及到17組試驗點，可分為析因點和零點，其中析因點為自變量的取值在A、B、C三個考察因素所構成的三維頂點，零點為區域的中心點，中心試驗組重復5次，用以估計試驗誤差。將17組試驗點按要求試驗后將其結果輸入到相應位置后，采用響應面分析軟件中Design-Expert8.05程序對所得數據進行分析處理，結果如表3。

表3 響應面試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface experiments results

所得模型P值＜0.0001，說明本試驗所建立的模型極顯著（P＜0.01），不同處理間的差異極顯著（P＜0.01）。模型失擬項的P值為0.0598，說明模型失擬項不顯著（P＞0.05）。一次項A、B、A2、B2、C2對模型的影響極顯著（P＜0.01）。一次項C對菌株HX-6的生長影響顯著（P＜0.05）。模型決定系數R2為98.74%，表明pH、培養溫度和氯化鈉含量對菌體生長的影響占98.74%，說明該模型的相關度較好，可用于該菌株最適生長條件的優化。

2.5 二因子互作效應分析

將試驗中所考察3個因素的其中一個因素固定于零水平，用DPS軟件制作出響應曲面圖，以研究另外兩個因素間的交互效應，結果見圖4。交互作用的強弱可以通過等高線的形狀來反映，橢圓形表示兩因素間交互作用顯著，而圓形則表示兩因素間交互作用不顯著。由圖4可知，隨著各交互因子編碼值的升高，OD600nm值呈上升趨勢，但當編碼值達到一定的組合后呈下降的趨勢。結果顯示，兩兩交互作用顯著，其中pH值和溫度交互作用更為顯著。

圖4 pH、培養溫度及NaCl含量交互作用對菌懸液吸光度值影響的響應曲面和等高線Fig.4 Response surface and contour line of the interaction between pH,temperature and NaCl concentration on the absorbance value of bacterial suspension

通過統計軟件Design Expert 8.0.5的優化，得到菌株HX-6生長的最適條件為：pH值為6.95，培養溫度33.79℃，培養環境中氯化鈉含量為0.52%，此條件下的OD600nm值預測值為0.42。由于考慮到實際操作的可行性，將菌株HX-6的最適培養條件修正為pH值為7.0，培養溫度34℃，培養基中氯化鈉含量為0.5%。為了驗證所建立模型優化結果的可靠性，采用修正后的工藝參數進行3次平行試驗，150r/min振蕩培養11 h后，菌株HX-6在波長600 nm處菌懸液的吸光值（OD600nm）平均為0.43，與理論預測值相近，表明建立的數學模型對菌株HX-6培養條件的優化具有實際應用價值。

3 結論

響應面法試驗設計方法是一種綜合試驗設計和數學建模的優化方法，通過分析不同因素間的交互作用，以達到較全面地反映試驗中各因素和水平的效果，回歸擬合全局范圍內因素與結果之間的函數關系，并且取得各因素最優水平值[16]；克服了正交試驗設計只能處理離散的水平值而無法找出整個區域中因素的最佳組合和響應值的最優值的缺陷，同時也有效減少了試驗次數[17-18]。本試驗通過響應面試驗設計和分析，結果顯示，培養溫度、培養環境中的pH值、培養液中氯化鈉質量分數這3個因素對菌株HX-6的生長影響都顯著，不是簡單的線性關系。同時，也建立了影響菌株生長的關鍵因素的二次多項回歸方程模型，此模型在試驗范圍內能夠準確的預測菌株HX-6的最適培養條件，得到其最優培養條件為pH值7.0，培養溫度34℃，培養基中NaCl含量0.5%。在此條件下培養11 h后，菌株HX-6菌懸液在波長600 nm處的吸光度值為0.43，其生長量與預測生長量相差無幾，表明響應面分析法可有效用于細菌菌株培養條件的優化。

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