麥芽糖基-β-環糊精與10-姜酚的包合作用研究

于 博，李云捷，余海忠，湯尚文，吳進菊

（湖北文理學院 化學工程與食品科學學院，湖北 襄陽 441053）

生姜是衛生部首批公布的藥食兼用植物資源，其在食品、藥品、化妝品及農業殺害劑等領域有著廣泛地應用。生姜中含有數十種具有生物活性的化學成分，主要包括酚類化合物、黃酮化合物以及揮發性的醛烯類[1]。姜酚是生姜中的多酚類物質，其具有抗氧化、抑菌、抗腫瘤、抗炎、強心、降壓、降血脂、降血糖、抗凝血等多種生物活性[2]。愈創木酚和β-羥基酮結構是姜酚生物活性的官能團結構基礎，苯環上連接的烴鏈長度對姜酚的生物活性具有較大影響。根據烴鏈長度，姜酚可分為6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚和12-姜酚等。在抗氧化能力上，3種常見的姜酚對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、超氧自由基和羥基自由基的清除能力的順序是10-姜酚＞8-姜酚＞6-姜酚[3]；在抗炎中對活性氧的抑制能力上10-姜酚＞8-姜酚＞6-姜酚[4]。研究還發現生姜的抗神經炎癥能力主要取決于10-姜酚，而不是6-姜酚，這主要是由于烷基鏈長度的增加，姜酚的抗神經炎癥能力不斷增加[5]。10-姜酚還具有通過抑制?；L素的降解來改善厭食癥的作用[6]。10-姜酚的研究目前還主要集中在分離純化[7-9]和生物活性[10]的探索上，對姜酚生物活性的保護策略研究較少。但10-姜酚中存在的愈創木酚結構和β-羥基酮結構使得其具有非?；顫姷睦砘再|，水溶性、熱穩定較差，且易被降解和氧化，這極大地限制了其應用范圍。目前提高姜酚穩定性的方法主要包括結構修飾方法和分子微膠囊法。本研究采用6-O-α-D-麥芽糖基-β-環糊精（6-O-α-maltosylβ-cyclodextrin，Mal-β-CD）包合10-姜酚的方法來穩定10-姜酚的生物活性有效態勢。

分子微膠囊技術是通過分子間的相互作用，將客體分子全部或部分包埋到主體分子中，屏蔽外部不利環境因素，有效地或選擇性地保護客體分子的特征官能團或活性中心。環糊精及其衍生物是分子微膠囊領域應用較多的一類主體分子，其化學性質穩定，具有疏水性空腔結構[11]，能夠識別各類具有不同結構特征的非極性客體[12-15]，從而形成主客體復合物。6-O-α-D-麥芽糖基-β-環糊精（Mal-β-CD）是在母體環糊精上通過糖苷鍵連接麥芽糖基團形成的具有良好水溶性和安全性的主體分子，其包合能力與母體環糊精類似[16]。本研究采用溶劑法制備10-姜酚/Mal-β-CD包合物，借助紫外光譜、紅外光譜、X-射線衍射技術、熱重及差示掃描量熱聯用分析等技術研究包合物結構特征，并采用分子模擬對接技術構建10-姜酚/Mal-β-CD包合物的超分子結構，以期擴大10-姜酚在食品和醫藥等領域的應用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

10-姜酚（純度98%）：成都德斯特生物技術有限公司；6-O-α-D-麥芽糖基-β-環糊精（純度98%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

AL204電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；FD-1-50真空冷凍干燥機：北京博醫康實驗儀器有限公司；D8 Advance X射線衍射儀：布魯克AXS有限公司；SDTQ600同步熱分析儀：美國TA公司；UV-2600PC紫外/可見光分光光度計、IRPrestige-21傅立葉紅外變換光譜儀：島津企業管理（中國）有限公司；QYC系列全溫培養搖床：上海新苗醫療器械制造有限公司；DW-86L626超低溫保存箱：青島海爾特種電器有限公司；PGJ-10-AS（超）純水機：武漢品冠儀器設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 10-姜酚/Mal-β-CD包合物及物理混合物的制備

稱取1.459 g Mal-β-CD（1 mmol），用30 mL超純水溶解，置于棕色瓶中，加入0.350 g 10-姜酚（1 mmol），在25 ℃恒溫振蕩器中，振蕩反應72 h。離心后取上清液過0.45 μm膜，冷凍干燥制得10-姜酚/Mal-β-CD包合物。分別稱取Mal-β-CD 1.459 g和10-姜酚0.070 0 g，混合均勻即為10-姜酚/Mal-β-CD物理混合物。

1.3.2 紫外光譜分析

分別稱取10mg的10-姜酚、Mal-β-CD、10-姜酚/Mal-β-CD物理混合物及包合物，分別溶于體積分數為50%的甲醇溶液中，以體積分數50%甲醇溶液為空白對照，進行紫外全波長掃描。

1.3.3 傅里葉紅外光譜分析

分別取3 mg的10-姜酚、Mal-β-CD、10-姜酚/Mal-β-CD物理混合物及包合物，分別加入150mg溴化鉀，壓片后置于傅里葉紅外光譜分析儀中，測定波數范圍為4000～400cm-1，分辨率為0.01cm-1，掃描次數為32次，室溫下進行紅外光譜掃描。

1.3.4 X-射線衍射分析

分別取10mg的10-姜酚、Mal-β-CD、10-姜酚/Mal-β-CD物理混合物及包合物，進行X-射線衍射。分析條件：室溫，Cu靶（Kα射線，波長=1.541 87 ?），掃描電壓40 kV，管電流40 mA，掃描速率2°/min，采樣間隔0.02°，掃描范圍為10～80 °。

1.3.5 熱重及差示掃描量熱同步分析

將5 mg左右的10-姜酚、Mal-β-CD、10-姜酚/Mal-β-CD物理混合物及包合物進行同步熱分析，記錄其熱分析圖譜。測定條件為：在純氮氣環境下進行掃描分析，掃描溫度范圍為40～600℃，掃描速率為10℃/min。

1.3.6 分子對接

在ChemDraw12.0軟件中構造10-姜酚，采用ChemDraw 3D 12.0軟件中的MM2 Minimize功能模塊對上述所有分子進行能量優化。Mal-β-CD分子的PDB文件來源于Pubmed數據庫中[17]。運用AutoDock分子模擬軟件，借助Vina模塊將對接參數設置為對接中心，坐標為主體分子的中心對稱點，對接盒子大小為20 ?×20 ?×30 ?，搜索步長為0.375 ?，計算構象數為10個，能差范圍為10 kcal/mol，采用遺傳學算法，其他參數均為默認設置。

2 結果與分析

2.1 紫外吸收光譜

在主客體超分子化學的研究中，通過比較超分子體系形成前后紫外光譜的變化，可以判斷超分子形成過程中是否形成新的化學鍵，客體分子是否全部或部分進入到主體分子之中。10-姜酚、Mal-β-CD、10-姜酚與Mal-β-CD包合物及混合物的紫外圖譜如圖1所示。由圖1可知，Mal-β-CD在紫外范圍內并無特征吸收峰，這主要是因為Mal-β-CD沒有共軛雙鍵結構；10-姜酚、10-姜酚與Mal-β-CD包合物及二者的物理混合物在紫外區均有吸收，這主要是由于10-姜酚具有苯環和β-羥基酮不飽和結構，而且三者的譜圖峰位、峰形基本一致，這說明在包合物形成的過程中，并沒有形成新的不飽和結構，10-姜酚與Mal-β-CD的相互作用可能是以非共價鍵的次級作用力為主導；根據二者分子結構特征，初步推斷Mal-β-CD的疏水性空腔與10-姜酚的非極性基團發生了疏水相互作用。

圖1 10-姜酚、Mal-β-CD、10-姜酚與Mal-β-CD包合物及10-姜酚與Mal-β-CD混合物的紫外圖譜Fig.1 UV spectrum of 10-gingerol,Mal-β-CD,10-gingerol and Mal-β-CD inclusion complex and 10-gingerol and Mal-β-CD mixture

2.2 紅外光譜

紅外光譜經常被用來研究包合物是否形成，通過對比主體、客體、二者物理混合物及其包合物的紅外光譜圖，通過特征吸收峰位置和強度的變化，來推斷主客體間是否發生包合作用。圖2為10-姜酚、Mal-β-CD、Mal-β-CD/10-姜酚包合物及其混合物的紅外光譜圖。由圖2可知，10-姜酚在3 526 cm-1處具有O-H的伸縮振動峰，在波數1 649 cm-1處具有C=O的特征吸收峰，在1520cm-1、1609cm-1、1460cm-1、1 439 cm-1處具有苯環的特征吸收峰；Mal-β-CD的紅外光譜具有羥基的伸縮振動峰（3 412 cm-1）、亞甲基的振動峰（2 928 cm-1）、糖苷鍵的伸縮振動峰（1 028 cm-1）。10-姜酚與Mal-β-CD物理混合物的特征吸收峰為二者紅外光譜的疊加，這表明混合物中二者之間沒有相互作用。10-姜酚與Mal-β-CD包合物的特征吸收峰與二者的物理混合物、10-姜酚的紅外光譜明顯不同，而與Mal-β-CD的紅外圖譜類似，在波數400～1700cm-1，10-姜酚的特征吸收峰減少明顯，尤其是苯環的特征吸收峰基本被母體Mal-β-CD的紅外光譜所掩蓋，這說明二者發生了相互作用，形成了新的物相；和其他三個紅外光譜相比較，包合物的圖譜沒有出現新的紅外吸收峰，這說明在10-姜酚與Mal-β-CD的包合過程中沒有形成新的共價鍵，主客體分子各自保留其原有的化學結構特征，包合物的形成不會影響到客體分子的生物功能特性。

圖2 10-姜酚（1）、Mal-β-CD（2）、10-姜酚與Mal-β-CD包合物（3）、10-姜酚與Mal-β-CD混合物（4）的紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectrogram of 10-gingerol(1),Mal-β-CD(2),10-gingerol and Mal-β-CD inclusion complex(3)and 10-gingerol and Mal-β-CD(4)mixture

2.3 X-射線衍射分析

X-射線衍射法在超分子化學的研究中具有廣泛用途，其可以判斷生成主客體固體包合物是否形成以及驗證包合物的純度。利用主客體晶體X射線衍射的不同，并對二者的物理混合物與包合物進行晶型解析，可以確證主客體分子間的包合作用。圖3為10-姜酚、Mal-β-CD、10-姜酚與Mal-β-CD包合物及混合物的X衍射圖譜。由圖3可知，10-姜酚在2θ=12.888°、17.139°、17.819°、19.699°、20.806°、22.294°、25.066 °、25.423 °等處有尖銳的衍射峰，Mal-β-CD在2θ為10～15°和15～25°處有兩處寬衍射峰，二者物理混合物的衍射峰大致為10-姜酚和Mal-β-CD衍射峰的疊加，由此可知，10-姜酚與Mal-β-CD直接混合后，其晶體類型均沒有發生變化；包合物在2θ為10～15°和15～25°處的衍射峰與Mal-β-CD類似，客體分子10-姜酚的特征衍射峰在包合物中消失，晶體類型明顯發生變化，這說明包合物中的10-姜酚分子的微環境發生了重大變化，這主要是由于10-姜酚的非極性基團與環糊精空腔通過疏水相互作用形成了新的物相，而致使包合物呈現出主體的無定形狀態。

圖3 10-姜酚（1）、Mal-β-CD（2）、10-姜酚與Mal-β-CD包合物（3）、10-姜酚與Mal-β-CD混合物（4）的X-射線衍射圖Fig.3 X-ray diffraction pattern of 10-gingerol(1),Mal-β-CD(2),10-gingerol and Mal-β-CD inclusion complex(3)and 10-gingerol and Mal-β-CD(4)mixture

2.4 熱重及差示掃描量熱聯用分析

熱重/差示掃描量熱聯用可同時分析物質在升溫過程中的重量變化和熱量變化，通過重量與熱量間的關系，分析物質的熱穩定性、脫水過程以及熔融過程。熱重/差示掃描量熱聯用技術廣泛地應用于環糊精及其衍生物的包合物表征，能夠精確地測量包合物熱性質，判斷包合物形成與否。重量變化是包合物形成的有力證據，通過對比10-姜酚、Mal-β-CD、二者包合物的同步熱分析圖譜，能夠表征10-姜酚與Mal-β-CD的包合作用以及包合物形成后對10-姜酚的穩定性影響。10-姜酚、Mal-β-CD、二者包合物的熱重（thermal gravity，TG）及差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）曲線如圖4所示，由圖4中Mal-β-CD的TG曲線可知，Mal-β-CD在溫度低于275℃時，重量基本沒有損失，說明其水分和揮發類組分很少；在270～450℃的升溫范圍內，失重明顯，這主要是其發生熱分解分子中的碳分解物逐步揮發所致；在450℃后重量趨于穩定，說明其此時已分解完全。由Mal-β-CD的DSC曲線可知，在280～350℃之間有一個顯著的吸熱峰，峰值溫度為約313℃，這是由于其吸熱分解引起。10-姜酚在165～330℃范圍內，重量快速損失，重量損失約91%，其DSC曲線表明該范圍內，10-姜酚吸熱分解，峰值溫度約為255℃，溫度升至385℃左右時，重量趨于平衡。10-姜酚/Mal-β-CD包合物的TG曲線顯示，在280～380℃范圍內重量下降明顯，而在160～260℃范圍內，包合物重量沒有明顯降低，包合物的熱重曲線與母體Mal-β-CD的熱重曲線近似一致，10-姜酚的特征吸熱峰消失，表明其不再以晶態形式存在，而是完全分散在母體Mal-β-CD中，熱流數據顯示，當溫度達到300℃時，包合物才熔融并大量分解，這表明通過與Mal-β-CD的包合，10-姜酚的熱穩定性得到了顯著提高。

圖4 10-姜酚（1）、Mal-β-CD（2）、10-姜酚與Mal-β-CD包合物（3）的熱重及差示掃描量熱圖Fig.4 TG/DSC curve of 10-gingerol(1),Mal-β-CD(2),10-gingerol and Mal-β-CD inclusion complex(3)

2.5 分子對接分析

圖5 10-姜酚與Mal-β-CD包合物三維超分子結構Fig.5 Three-dimensional supermolecular structure of 10-gingerol-Mal-β-CD inclusion complex

分子對接試驗常用于預測主客體分子形成超分子復合物時的取向和相互作用機制，通過幾何和能量匹配，環糊精的疏水性空腔與非極性基團完成相互識別。通過使用Autodock方法對包合物的三維超分子結構模擬，能夠推斷了包合方式，是研究超分子化合物的有效技術[18]。圖5是10-姜酚與Mal-β-CD通過分子模擬建立的超分子模型。由圖5可知，由于疏水相互作用，Mal-β-CD將10-姜酚的苯環和非極性側鏈包埋到疏水空腔中，同時發現10-姜酚與Mal-β-CD超分子復合物中形成了4個氫鍵，氫鍵鍵長分別為2.5 ?、2.0 ?、2.4 ?、2.5 ?；10-姜酚與 Mal-β-CD包合物的化學計量為1∶1，結合能為-19.32kJ/mol。分子對接試驗表明，Mal-β-CD通過包合10-姜酚，能夠有效地保護其活性結構，這將有助于提高10-姜酚的抗熱性和水溶性，這與同步熱分析的試驗結論相一致。

3 結論

10-姜酚是生姜中天然存在的酚類化合物，其具有良好的生物活性，在功能性食品、醫藥和化妝品領域具有廣闊的應用前景。本研究采用溶劑法聯合冷凍干燥技術制備了10-姜酚/Mal-β-CD的包合物，通過紫外光譜、紅外光譜、X-射線衍射、熱重及差示掃描量熱聯用技術表征了復合物的結構特征，證實Mal-β-CD對10-姜酚具有良好的包合能力。結合分子對接分析，10-姜酚的苯環結構進入到環糊精的疏水性空腔中，維持復合物穩定的作用力包括疏水相互作用和氫鍵；二者之間沒有形成新的化學鍵，10-姜酚以無定形狀態存在于包合物中，其熱穩定性得到了明顯提高。因此，以麥芽糖基-β-環糊精為分子膠囊的壁材，通過10-姜酚的微膠囊化，有助于拓展10-姜酚在功能性食品、藥品及化妝品領域的應用范圍。

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