苜蓿根瘤菌綠色熒光蛋白標記株的構建及對菌株結瘤固氮能力的影響

楊曉玫，周 彤，阿 蕓，師尚禮，

(甘肅農業大學 草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)為發光蛋白，最初在維多利亞多管水母中發現，吸收光譜的最大峰值為395 nm，為紫外光；發射光譜最大峰值為509 nm，呈現綠色熒光。gfp分子量小，對細胞無毒，只編碼238 氨基酸，不干擾標記蛋白的功能和定位，其具有的特點性質及熒光特性穩定、檢測方便可靠的優點，使gfp在細菌的分子標記研究中的應用非常廣泛。GFP基因標記采用三親本雜交的方法，將供體菌、輔助菌和受體菌混合培養，用熒光顯微鏡選擇平板上長出的單菌落，肉眼可見接合子菌落發出的綠色熒光[1]。史巧娟[2]應用gfp基因在華癸中生根瘤菌中的異源表達，構建基于gfp的廣宿主范圍啟動子探針載體，通過鳥槍克隆技術以gfp為報告基因原位活體監測華癸中生根瘤菌侵染紫云英的早期結瘤過程。HumbertoJ O Ramos[3]應用gusA和gfp基因標記大豆根瘤菌，檢測其占瘤率[3]。

運用三親本雜交方法的熒光標記，即利用分子生物學手段將標記熒光基因引入到目的根瘤菌中，從而利用導入根瘤菌的熒光基因所編碼的酶作用于多種底物而產生顏色反應或發光現象，從而能夠比較直觀地跟蹤所要研究的目的根瘤菌。三親本雜交是在雙親本雜交的基礎上建立起來的。Chalfie 等[4]首次在果蠅、大腸桿菌等生物體內成功表達綠色熒光蛋白(GFP)基因，因此，人們將攜帶有綠色熒光標記的果蠅、大腸桿菌等生物體作為又一快速高效的研究工具，應用于分子生物學和細胞生物學領域，三親本雜交的方法得以廣泛的應用。

目前，已有青色熒光蛋白成功運用三親本雜交法構建苜蓿cfp熒光標記菌株，不影響苜蓿的固氮能力和植物生長指標[5]，三親本雜交是應用比較廣泛的接合轉移方法，但熒光資源短缺，一種顏色的熒光質粒蛋白不便于同時多元化標記。gfp熒光蛋白是cfp熒光蛋白的突變體，基于綠色熒光蛋白成功轉導大腸桿菌并穩定表達，以三親本雜交方法構建gfp熒光標記苜蓿根瘤菌的基礎上，通過無氮培養基和抗生素選擇平板對標記株進行篩選，對優良菌株進行遺傳穩定性驗證和回接鑒定，并通過測定回接植株的生物量、結瘤特性和發光根瘤的數量，探討優良標記株的熒光蛋白表達能力。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 受體菌株為苜蓿根瘤菌RhizobiummelilotiGN5、苜蓿中華根瘤菌標準菌Sinorhizobiummeliloti12531和苜蓿中華根瘤菌標準菌Sinorhizobiummeliloti343。

苜蓿根瘤菌RhizobiummelilotiGN5分離自甘農5號紫花苜蓿(Medicagosativacv. Gannong No.5)種子，由教育部草業生態系統重點實驗室提供，經中科院微生物鑒定與保藏中心鑒定；苜蓿中華根瘤菌標準菌Sinorhizobiummeliloti12531和苜蓿中華根瘤菌標準菌Sinorhizobiummeliloti343,購自中國科學院微生物保藏中心。供體菌為含gfp熒光基因質粒的大腸桿菌E.coliGFP104。輔助菌為大腸桿菌EscherrichiacolipRK2073。

1.1.2 培養基 YMA培養基用于根瘤菌的增殖培養，參照文獻[6]的方法配制。

TY(Yeast Tryptone Agar)培養基用于觀察檢測標記菌株熒光表達能力，參照文獻[7]的方法配制。LB(Luria Bertani)培養基用于增值培養供體菌和輔助菌，參照文獻[8]的方法配制。SM(Supplemental Medium)培養基用于分離培養菌體，參照文獻[9]的方法配制。Winogradsky無氮固體培養基用于快速檢測接合子的固氮能力，參照文獻[10]的方法配制。 各種培養基均以121℃濕熱滅菌26 min。

含抗生素固體培養基的配制：抗生素溶液氨芐(Amp)和慶大霉素(Gm)各0.005 g，加入100 mL去離子水溶解后經0.22 μm的無菌濾膜過濾，制成濃度為50 μg/mL的溶液。待配制的固體培養基冷卻至40℃時加入，制成TY/LB/SM含藥固體平板。

1.1.3 植物材料 甘農5號紫花苜蓿種子，由教育部草業生態系統重點實驗室提供，種子發芽率90.6%，凈度98.5%。

1.2 熒光標記根瘤菌的構建

三親本雜交法熒光標記根瘤菌的構建，混合菌體是在凌瑤[11]的方法上予以改進，即在含慶大霉素(Gm)50 μg/mL和氨芐(Amp)50 μg/mL的LB固體培養基活化供體菌E.coli104和輔助菌E.coli2073。28℃培養16～18 h，分別轉接菌株到含50 μg/mL Gm和50 μg/mL Amp的LB液體培養基中，37℃、120 r/min搖床震蕩培養至菌體生長對數期(D600 nm=0.5)。將以上供體菌、輔助菌、受體菌的菌液各1.5 mL混合,8 000 r/min離心5 min得到混合菌體沉淀，棄上清液后向沉淀加入1 mL無抗生素TY液體培養基，振蕩混勻并8 000 r/min離心5 min，棄上清液后留混合菌體沉淀。

混合培養在TY固體平板表面每皿貼3片0.22 μm無菌濾膜，菌體沉淀加1 mL無菌水打散成濃菌液，加0.2 mL濃菌液至濾膜中央，28℃正置2 h后倒置培養。2～3 d后用鑷子取出已長出培養物的濾膜，放入無菌西林瓶中，5 mL無菌水洗菌體后用無菌水稀釋10倍，取0.2 mL菌液在SM+Gm固體平板上涂布，28℃培養7 d，挑取平板上50個單菌落，依次編號，分別點接于無抗生素TY培養基和無氮培養基，每菌株3次重復，28℃培養至菌落出現。檢測菌落后，在熒光顯微鏡下選擇可發綠色熒光單菌落的培養菌落轉接于無氮培養基，無氮平板上能正常生長的菌株則為熒光標記根瘤菌(接合子)。

1.3 標記根瘤菌的遺傳穩定性檢測方法

甘農5號紫花苜蓿熒光標記菌的篩選參照文獻[12]的方法，參照文獻[13]的方法進行回接試驗，盆栽試驗采用隨機區組設計[14]，每菌株4次重復，對照組為不接菌的處理。每盆栽種5粒滅菌苜蓿種子，重復單個無菌沙培盆栽，出苗3 d后留苗一株。分別標號后放入關照培養室，日常處理參照文獻[12]的方法，45 d后測定植株的株高、根長、生物量、根瘤重和單株結瘤數。

根瘤固氮酶活性測定：使用乙炔還原法等[15]的方法測定，進樣溫度150℃，柱溫175℃，，FID170℃，進樣50 μL，每處理3次重復。

標記菌占瘤率的測定：蒸餾水慢慢清洗苜蓿苗根系，最后用無菌水沖洗3～5次，收集苜蓿苗單株上的所有根瘤，表面滅菌后用熒光顯微鏡觀察，有綠色熒光的根瘤為熒光標記株侵染形成[9]，按照以上方法，篩選出熒光蛋白表達能力強、占瘤率高、熒光質粒遺傳穩定、固氮酶活性高且能使苜蓿植株生物量增加的熒光標記菌株。

1.4 數據分析

以SPSS 13.0統計軟件對數據進行單因素方差分析，用Duncan法進行數據的多重比較，采用Excel 2007制圖[16]。

2 結果與分析

2.1 熒光標記根瘤菌接合子的構建和初選

3種根瘤菌分別從SM+Gm平板上選出各20個可以在TY培養基上形成菌落的接合子，用熒光顯微鏡壓片觀察其熒光蛋白表達均出現綠色熒光(圖1)。

在S.meliloti12531菌株的接合子中，6個菌株的3次重復均能在無氮固體培養基上正常生長(表1)，表

2中R.melilotiGN5的8個菌株的3次重復均能在無氮培養基上生長，表3中R.meliloti343的4個菌株的3次重復均能在無氮培養基上生長，表明菌株的固氮能力能夠穩定遺傳；綜合接合子的發光及生長特性，篩選出S.meliloti12531菌株的6個接合子,R.melilotiGN5菌株的8個接合子，R.meliloti343菌株的4個接合子，由此可見在SM+Gm上獲得的菌株大部分在傳代過程固氮性能并不穩定，僅約13%的菌體可穩定遺傳。因此，無氮培養基能很穩定的篩選熒光標記固氮菌株。

圖1 3種綠色熒光標記根瘤菌在顯微鏡下的熒光表達Fig.1 Fluorescence expression of three green fluorescent protein labeled strains of rhizobia

接合子編號12345678910S.meliloti12531++++-++++---+++-++---+++++-+-+R.melilotiGN5+++++++++---+++--+---+++++++-+S.meliloti343+-+++++-+---+-+-++---++++----+接合子編號11121314151617181920S.meliloti12531--+---++++-++--+++--------+-+-R.melilotiGN5--+-+-++++--++-+++-------++---S.meliloti343-++---+--+-+++++++-------++++-

注:“+”表示接合子能在無氮培養基上生長，“-” 表示接合子不能在無氮培養基上生長，“+++”表示接合子3次重復均能在無氮培養基上生長，“---”表示接合子3次重復均不能在無氮培養基上生長，“+--”等表示接合子3次重復中不完全在無氮培養基上生長

2.2 熒光標記根瘤菌的遺傳穩定性

初選獲得的接合子在無抗生素的TY固體培養基上連續傳代10次后，熒光質粒的丟失率均低于10%(表2)，可見gfp熒光質粒隨宿主菌的傳代能穩定復制進入下一代，說明與熒光質粒的結合能力較好的菌株，固氮能力比較穩定。其中丟失率為0的R.melilotiGN5-gfp2、R.melilotiGN5-gfp4、S.meliloti343-gfp2、S.meliloti12531-gfp2及S.meliloti12531-gfp的熒光蛋白表達能力也最強，最后進行宿主植株回接試驗。

2.3 熒光標記根瘤菌的回接鑒定和篩選

接種標記菌的苜蓿幼苗的生物量和株高與未接種植株(CK)有明顯的差異。其中，甘農5號紫花苜蓿回接中CK1-gfp2，CK2-gfp2及CK3-gfp4菌株的生物量高出對照74%～81%，與對照差異顯著(P<0.05)，紫花苜蓿343回接中CK1-gfp2，CK2-gfp4和CK3-gfp4菌株的生物量高出對照65%～87%，與對照差異顯著(P<0.05)(表3)。甘農5號紫花苜蓿回接中CK1-gfp2，CK2-gfp2和CK3-gfp4植株株高高出對照33%～85%，與對照差異顯著(P<0.05)，紫花苜蓿343回接中CK1-gfp2、CK2-gfp4及CK3-gfp4植株株高高出對照48%～82%，與對照差異顯著(P<0.05)。5株標記菌回接植株的根長與對照差異顯著(P<0.05)(表4),表明苜蓿根瘤菌熒光標記株和接種根瘤菌一樣能有效的促進幼苗地上部分的生長，增加干物質的積累和生物量，而與接種根瘤菌菌株之間無顯著的差異。可見優良標記菌額外的標記質粒要消耗碳水化合物，未顯著影響菌體對植株的促生作用，仍具備熒光的表達特性。因此，在優良的標記菌中，攜帶gfp熒光標記基因質粒的熒光表達效率高且耗能低。

表2 熒光質粒丟失率

表3 標記根瘤菌處理下甘農5號苜蓿幼苗的生長

注：同列不同小寫字母表示同一生長指標接種不同標記菌的處理間差異顯著(P<0.05),CK為接種無菌水的對照，CK1為接種出發菌R.meliloti343苜蓿根瘤菌，CK2為接種出發菌R.meliloti12531苜蓿根瘤菌，CK3為接種出發菌R.melilotiGN5苜蓿根瘤菌，下同

表4 標記根瘤菌處理下紫花苜蓿343苜蓿幼苗的生長

根瘤菌主要是侵染寄主植株形成有效根瘤，未接種對照根瘤的鮮重和數量等均較低，此次試驗中篩選出5株熒光表達強度較高、回接植株根瘤數、固氮酶活性和單個根瘤鮮重較顯著的熒光標記株(圖1)，其中，在甘農5號紫花苜蓿回接中CK1-gfp2，CK2-gfp2和CK3-gfp4的根瘤數高出對照20%～32%，固氮酶活性為對照的22.9～31.9倍，單個根瘤鮮重高出對照23%～30%，除CK1-gfp2處理占瘤率高于CK3-gfp4處理13.7%外，其他根瘤指標與CK3-gfp4處理差異不顯著(P>0.05)，CK1-gfp2可作為甘農5號的標記菌株優良菌株研究(表5)。在紫花苜蓿343回接中CK1-gfp2，CK2-gfp4及CK3-gfp4的根瘤數高出對照10%～78%，固氮酶活性為對照的28.9～39.3倍，單個根瘤鮮重高出對照35%～60%，除CK1-gfp2處理占瘤率高于CK3-gfp4處理7.04%外，其他根瘤指標與CK2-gfp4處理差異不顯著(P>0.05)。依據植物促生能力、占瘤率和結瘤情況數據分析， 表明CK1-gfp2及CK2-gfp4可分別作為紫花苜蓿343的優良標記菌株用于更深研究(表6)。結果表明，三親本雜交后代的相同供體菌株中固氮能力和結瘤等之間的差異不顯著，說明三親本雜交方法質粒通過輔助菌株接合受體菌株的整個過程，對不同接種根瘤菌菌株的固氮能力和結瘤能力未產生明顯的影響，能作為研究苜蓿根瘤菌的有效示蹤熒光。

表5 標記根瘤菌對甘農5號紫花苜蓿幼苗根瘤的影響

表6 標記根瘤菌對紫花苜蓿343幼苗根瘤的影響

3 討論

目前，國內外對苜蓿根瘤菌優良菌株的篩選頗有研究，已有報道用三親本雜交方法成功構建出遺傳穩定的cfp熒光標記苜蓿根瘤菌[5]，三親本雜交是在雙親本雜交的基礎上，質粒在輔助菌的協助下進入受體菌，如將gfp熒光基因導入到青蒿轉基因芽后能夠穩定表達[17]。gfp是良好的細胞間信號傳遞的動態標記分子，有敏感的標記檢測率[18]。研究中，運用三親本雜交方法高效構建遺傳穩定的gfp熒光標記根瘤菌，構建的標記根瘤菌在TY固體培養基上連續傳代10代后，gfp熒光質粒的丟失率均低于10%。各出發菌與其綠色熒光標記菌接種苜蓿幼苗的單株生物量、根長、株高和固氮酶活性等均顯著(P<0.05)高于未接種的處理，說明出發菌與其熒光標記菌均具有明顯的促生作用，且熒光標記根瘤菌不會對苜蓿幼苗的根系產生影響。

三親本雜交法中，培養基上出現的假接合子很難區分。試驗中，假接合子或喪失固氮能力的標記菌株比例較高，用反復的形式觀察和宿主回接試驗是否結瘤，太過復雜耗時[9]。因此，借助根瘤菌在無氮培養基上正常生長的特性，用無氮和TY固體培養基同步驗證菌種的固氮和發光特性，同時也驗證了陳力玉等[5]的研究結果，簡化了篩選驗證的流程，提高了標記菌選育效率，具有良好的應用前景。

4 結論

綠色熒光標記根瘤菌接種苜蓿幼苗的單株生物量、株高和根長等與對應的出發菌相比，無顯著差異，表明熒光質粒的導入沒有影響菌株對苜蓿幼苗生物量積累的促進效果。外源質粒對菌株共生固氮能力的影響可能是促進、也可能是抑制[19]。一些根瘤菌在導入外源質粒后侵染結瘤和共生固氮能力會顯著提升[20]，可使宿主植株的生物量、根瘤鮮重及植株含氮量增加[21]。試驗研究發現對標記菌株的結瘤及促生能力進行驗證很重要，僅次于熒光蛋白表達強度。同一出發菌株的熒光標記菌結瘤能力和固氮酶活性無較大的差異。

在固氮能力指標中，綠色熒光標記根瘤菌和對應的出發菌與其對照在接種的苜蓿幼苗的生物量、根瘤數、根瘤固氮酶活性、單個根瘤鮮重和占瘤率方面的表現有明顯差異。甘農5號紫花苜蓿回接中CK1-gfp2，CK2-gfp2和CK3-gfp4菌株的生物量高出對照74%～81%，根瘤數高出對照20%～32%，單個根瘤鮮重高出對照23%～30%，固氮酶活性為對照的22.9～31.9倍，與對照差異顯著(P<0.05)，紫花苜蓿343回接中CK1-gfp2，CK2-gfp4和CK3-gfp4菌株的生物量高出對照65%～87%，根瘤數高出對照10%～78%，單個根瘤鮮重高出對照35%～60%，固氮酶活性為對照的28.9～39.3倍，與對照差異顯著(P<0.05)。

研究最終獲得了理想的標記根瘤菌，形成的根瘤的熒光表達能力強，與未接種菌株易于區分(圖1)，與未接種相比有良好的促生能力，其中甘農5號紫花苜蓿標記菌株CK1-gfp2、紫花苜蓿343標記菌株CK1-gfp2及CK2-gfp4熒光蛋白表達強度、占瘤率、根瘤的固氮酶活性等均高出其他標記菌株，可用于進一步的根瘤菌示蹤研究。

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