微波輔助萃取藍莓中花青素降解工藝研究

薛宏坤，徐 浩，朱廣浩，鄭先哲

(東北農業大學 工程學院，哈爾濱 150030)

0 引言

藍莓中富含豐富的花青素、維生素C和維生素E[1-2]，這些活性成分具有較高的營養價值，有益于人體健康。其中，花青素具有抗氧化、清除人體自由基、抗炎、保護心腦血管和緩解視疲勞等功效[3-4]，在食品、保健品、藥品和化妝品等行業中有著巨大的應用潛力[5]。由于花青素屬于熱敏性成分，對高溫、光、氧氣等外界條件有很強的敏感性[6]。

如何從藍莓中獲取高得率、低降解率的花青素成為科研工作者研究的熱點話題。造成花青素降解的因素有內因和外因：內因是花青素自身結構，由于花青素具有多個酚羥基，根據取代基的不同，穩定性差異較大，甲基化能增加花青素的穩定性，羥基化使花青素穩定性降低[7]；外因國內外學者也進行了相關研究。王芳等[8]研究了溫度對藍莓活性成分影響，表明高溫可加快活性成分降解；Chan[9]等研究微波輔助萃取植物中的花青素，表明微波輻射使萃取體系極性分子吸收微波能，溫度升高，高溫加速花青素降解；Reyes等[10]研究不同pH下花青素降解特性，研究發現pH越高花青素降解速率越快；Ochoa等[11]研究光照對花青素降解速率的影響，表明在光照下花青素的降解明顯高于避光條件；Chung等[12]研究金屬離子對花青素降解的影響，研究發現Fe3+、Cu2+加速花青素降解；Dorota等[13]研究向花青素中通入氧氣，發現隨通氧量增加，花青素降解速率增加；Veridiana等[14]研究在櫻桃中加入適量的Vc能顯著降低花青素降解速率。以上學者僅對影響花青素降解的因素進行研究，但微波輔助萃取工藝對花青素降解影響尚未見報道。

本文研究主要內容：通過單因素試驗，考查微波強度、萃取時間、乙醇濃度、料液比對花青素降解規律的影響；以花青素降解率最低為目標，通過二次正交旋轉中心組合設計試驗來優化合理的工藝參數。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

挑選成熟度均一、籽粒飽滿的藍莓置于冰箱中冷凍，在試驗前從冰箱中取出，解凍3h，然后放在九陽打漿機中進行打漿；將果漿置于玻璃皿中，放在冰箱中冷凍12h后，置于TD-50凍干機(上海浦東冷凍干燥設備有限公司)凍至24h，用植物性粉碎機進行粉碎，過40目篩，制成果粉，避光密封保存與冰箱中備用。

試劑：香草醛、濃鹽酸、甲醇、無水乙醇均為分析純，購自于天津市富宇精細化工有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 萃取過程

1)萃取體系的構建：用AB204-S型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)準確稱取2.000 0(±0.000 5)g藍莓粉置于萃取容器中，加入試驗預先確定體積和濃度的乙醇作為萃取劑來構建萃取體系。

2)微波萃取過程：將萃取容器置于微波工作站(MWS,加拿大FIOS公司)的中央，連接溫度和壓力光纖傳感器，將傳感器的探頭置于萃取體系內，利用FIOS軟件實時測定萃取液內部溫度和壓力的變化。

3)萃取體系渣液分離：經微波處理后萃取體系倒入離心管中，置于LG10-2.4A(北京京立離心機有限公司)離心機中以4 000r/min、15min離心，其目的將上清液和殘渣分離，用一定濃度乙醇洗滌殘渣，直到殘渣無色為止；收集多次洗滌的渣液置于100mL容量瓶中，用一定濃度的乙醇定容至刻度得到渣液備用；將上清液用一定濃度乙醇定容100mL容量瓶中得到原液備用。

4)顯色液制備：A液取1.000g香草醛置于100mL容量瓶中，用甲醇定容到100mL混均；B液取8 mL的濃鹽酸置于100mL容量瓶中，用甲醇定容到100mL混均。將A液與B液1∶1混合制得顯色液。

1.2.2 花青素萃取率測定

采用低濃度香草醛-鹽酸法[15]測定藍莓中花青素萃取率和降解率。方法如下：用移液槍準確移取1.0mL原液置于10mL比色管中，用一定濃度的乙醇將原液稀釋10倍；然后從稀釋的原液中取出2 mL置于另一個10mL比色管中，加入10mL顯色液，混勻后置于30℃DK-98-IIA型恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)中，30min(避光)。用LAMBDA35型紫外-可見分光光度計(美國Perkin Elmer公司)在500nm處測定原液的OD值，利用標準方程y=1.612x-0.048 5[16](決定系數R2=0.998 9)計算出藍莓中的花青素的濃度值，最后通過花青素萃取率的計算公式計算出花青素萃取率，其公式為

(1)

其中，D為花青素萃取率(%)；C為花青素濃度(mg/mL)；V為定容體積(mL)；n為稀釋倍數；W為花青素總量(mg)。本研究中新鮮藍莓中100g果粉花青素總含量為101.17mg。

1.2.3 花青素降解率測定

用移液槍準確移取2 mL的渣液置于10 mL的比色管中，加入10 mL的顯色液，以下的操作步驟同原液OD值測定方法相同。使用上述方法測定渣液中花青素含量，即為花青素殘留率，通過式(2)[17]，可計算得到微波輔助萃取過程中花青素的降解率，即

Y降解率=1-Y萃取率-Y殘留率

(2)

1.2.4 試驗設計

選用微波強度(W/g)、萃取時間(s)、乙醇濃度(%)、料液比 (g/mL)作為試驗因素，以藍莓中花青素降解率為試驗指標進行試驗設計，如表1所示。

表1 單因素試驗的因素和水平

1)單因素試驗。以藍莓為原料，選取微波強度(50～250W/g)，萃取時間(0～100s)，乙醇濃度(20%～80%)，料液比(1∶10～1∶50)作為試驗因素，以花青素降解率為目標因素。每組試驗重復3次，并對試驗數據進行方差分析。

2)組合試驗。選用微波強度、萃取時間、乙醇濃度、料液比作為中心組合試驗的影響因素，采用響應曲面法(RSM)建立試驗參數的回歸模型，研究試驗因素對花青素降解率的影響。各因素的取值范圍如表2所示。

表2 試驗設計因素水平及編碼表

利用Design-Expert ver6.0(SAT-EASE, Inc., Last September,UK)對試驗進行設計，并對所有的數據進行分析，采用響應面分析法得到二次回歸模型為

(3)

其中，b0為截距回歸系數；bi為線性回歸系數；bii為交互項的回歸系數；Xi、Xj為自變量。

1.3 數據處理

分別采用SigmaPlot12.5(SPSS, Inc., Chicago, US)軟件進行作圖和DesignExpert ver6.0(SAT-EASE, Inc., Last September,UK)軟件，構建響應曲面模型，研究因素之間的交互影響及對藍莓花青素的工藝參數進行優化和驗證，確定本研究的可靠性。

2 結果與討論

2.1 微波強度對花青素降解率的影響

選取萃取時間為50s，乙醇濃度50%，料液比為1∶30，考查不同微波強度對花青素降解率的影響，結果如圖1所示。

圖1 不同微波強度對花青素降解率的影響

由圖1可知：隨著微波強度的增加，藍莓中花青素降解率呈現先降低后升高的趨勢。當微波強度在150W/g時，花青素降解率達到最小值5.66%；當微波強度在50～150W/g范圍內，隨著微波強度的增加，花青素降解率降低；當微波強度在150～250W/g范圍內，隨著微波強度的增加，降解率增加。其原因是隨著微波強度的進一步增加，萃取液溫度迅速增加，花青素是熱敏性物質，當萃取液溫度到50℃時，花青素結構被破壞，50%以上的花青素發生降解[18]；微波強度在150W/g以上時，萃取液的溫度均大于50℃，從而使花青素降解率增加。

2.2 萃取過程對花青素降解率的影響

選取微波強度為150W/g，乙醇濃度為50%，料液比為1∶30，考查不同萃取時間對花青素降解率的影響，結果如圖2所示。

由圖2可知：隨著萃取時間的延長，藍莓中花青素降解率呈現先降低后升高的趨勢。當微波萃取時間在50s時，降解率達到最小值5.57%。當萃取時間在0～50s范圍內，降解率隨萃取時間的增加而降低，原因是此時花青素萃取率隨時間的延長而增加，故花青素降解率降低；隨著萃取時間的延長，花青素降解率增加。由于隨著微波輻射時間的延長，熱積累效應增強，溫度迅速升高。有微波萃取條件下花青素降解規律和阿倫尼烏斯方程可以導出，花青素降解量與萃取體系溫度的關系方程，其方程[19]為

(4)

由式(4)可知：溫度越高，花青素降解量越大，故花青素降解率增加。

圖2 不同萃取時間對花青素降解率的影響

2.3 乙醇濃度對花青素降解率的影響

選取微波強度為150W/g、萃取時間為50s、料液比為1∶30，考查不同乙醇濃度對花青素降解率的影響，結果如圖3所示。

圖3 不同乙醇濃度對花青素萃取率和降解率的影響

由圖3可知：當乙醇濃度在50%時，花青素萃降解率達到最小值7.96%；當乙醇濃度在20%～50%范圍內，花青素降解率隨乙醇濃度的升高而降低。當乙醇濃度在50%時，乙醇極性與花青素極性相似，根據相似相容原理，故此時花青素萃取率最高[16]，降解率最低；當乙醇濃度進一步增加，高濃度乙醇破壞花青素-蛋白質和花青素-纖維素之前的氫鍵和疏水鍵[20]，造成花青素結構被破壞，故花青素降解率增大。

2.4 料液比對花青素降解率的影響

選取微波強度為150W/g、萃取時間為50s、乙醇濃度50%考查不同料液比對花青素萃降解率的影響，結果如圖4所示。

圖4 不同料液比對花青素萃取率和降解率的影響

由圖4可知：當料液比在1∶30時，花青素降解率達到最小值3.79%；當料液比在1∶10～1∶30范圍內，花青素的降解率隨料液比的升高而降低；當料液比在1∶30～1∶50時，花青素降解率隨料液比的增加而增加。一方面由于固體內部存在傳質極限，因此當溶劑量增大時，驅動力不再增大[21]，溶劑吸收消耗微波能，使得進入藍莓顆粒內的微波能少，細胞壁破壞能力減弱，花青素萃取率降低，降解量增加；另一方面由于料液比的增加，加快了其它雜質的溶出，溶出的雜質加速花青素降解，因此花青素降解率增加。

3 花青素的降解工藝優化

3.1 微波輔助萃取參數交互作用分析

按照表3中試驗的設計編碼條件進行中心組合試驗，以花青素降解率為試驗指標，進行數據統計分析。

表3 中心組合試驗設計和結果

續表3

表3中，X1為微波強度(W/g)；X2為萃取時間(s)；X3為乙醇濃度(%)；X4為料液比(g/mL)。

3.1.1 花青素降解率的方差分析和回歸方程

由方差分析可知，該模型極顯著(p<0.01)，失擬項不顯著(p>0.05)。決定系數R2=0.923 5，說明92.35%的響應值變化能夠用該模型解釋。由方差分析表中各因素的F值大小可知：在花青素萃取率的回歸模型中，X1、X4、X12、X42項極顯著，X2、X3、X1X4、X2X3項顯著。試驗選取的各因素對藍莓花青素降解率的影響程度大小順序依次為微波強度>料液比>萃取時間>乙醇濃度。剔除模型中不顯著項，得到藍莓花青素降解率的回歸方程，即

(5)

其中，X1為微波強度(W/g)；X2為萃取時間(s)；X3為乙醇濃度(%)；X4為料液比(g/mL)；Y為藍莓花青素萃取率(%)。

3.1.2微波強度和料液比對花青素降解率交互影響

當萃取時間和乙醇濃度在50s和50%水平時，考察料液比和微波強度對藍莓花青素降解率的交互影響，如圖5所示。

圖5 微波強度和料液比對花青素降解率的影響

當料液比在某一水平時，隨微波強度的增加，花青素降解率呈現先減小后升高的趨勢。其原因同單因素2.1。 當微波強度一定時，花青素降解率隨料液比的增加呈現先降低后升高的趨勢，其原因是隨料液比的增加，花青素萃取率增加，因此花青素降解率降低。當料液比較高時，其他極性醇溶性成分溶解，抑制花青素溶解，花青素萃取率下降，故花青素降解率增加。當料液比在1∶30和微波強度在150W/g時，花青素萃取率最低7.23%。

3.1.3萃取時間和乙醇濃度對花青素降解率的交互影響

當微波強度和料液比在150W/g和1∶30水平時，考察萃取時間和乙醇濃度對藍莓花青素降解率的交互影響，如圖6所示。

圖6 萃取時間和乙醇濃度對花青素降解率的影響

由圖6可知：乙醇濃度和萃取時間顯著影響花青素降解率。乙醇濃度在某一水平時，花青素降解率隨萃取過程呈現逐漸增加的趨勢。由于花青素降解符合一級反應動力學模型[22]，即

C=C0·exp(-kt)

(6)

其中，k為反應速率常數。微波處理過程中溫度對k的影響采用Arrhenius經驗方程[23]，即

(7)

由式(6)、式(7)可知：隨著萃取時間的延長，萃取液的溫度升高，反應速率常數k增大，故花青素降解率增加。當萃取時間一定時，花青素降解率隨乙醇濃度的增加而增加。其原因是隨乙醇濃度的增加，萃取體系蒸餾水含量減少，其沸點低于蒸餾水，因此高濃度的乙醇更易吸收微波能，使萃取體系溫度升高，高溫加速花青素降解，故花青素降解率隨乙醇濃度的增加而增加。

3.2 最優工藝參數優化

在建立藍莓花青素微波強度、萃取時間、乙醇濃度、料液比的回歸模型的基礎上，采用中心組合試驗設計(Response Surface/Central Composite Design)對萃取藍莓花青素的工藝參數進行優選組合，優化后的工藝參數和最優結果如表4所示。

表4 優化結果和驗證值

以花青素降解率最低作為目標，所得的最優工藝參數為：微波強度為150W/g、萃取時間為50s、乙醇濃度為50%、料液比為1∶30。在最優工藝條件下進行驗證試驗，經過3次試驗確定的最優結果為8.36%，而回歸模型的預測值為8.13%。試驗值與預測值相對誤差為0.23%，表明了優化結果的合理性，并進一步驗證了回歸模型的適用性。

4 結論

藍莓中花青素降解率隨微波強度、萃取時間、乙醇濃度、料液比的增加均呈現先減小后升高的趨勢。通過中心組合試驗，以花青素降解率最低為目標，確定了最優的工藝參數組合為：微波強度為150W/g、萃取時間為50s、乙醇濃度為50%、料液比為1∶30，在此條件下花青素降解率為8.36%。本研究結果可為工業化生產提供理論依據。

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