HPLC法同時測定不同產地五味子中5種木脂素類成分的含量

遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連 116600

五味子為木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill的干燥成熟果實，主產于遼寧省，吉林、黑龍江產量也相對較大,臨床用于治療久咳虛喘、心悸失眠、盜汗、津傷口渴等癥[1]。木脂素類化合物是五味子中含量較高且具有顯著生物活性的成分[2]，藥理作用顯著，其單體和總木脂素已經廣泛應用于在對抗炎癥[3]、肝損傷修復[4]、腫瘤的預防和治療[5]等方面。本研究建立HPLC同步測定5種木脂素類化合物含量的分析方法，對五味子藥材的質量進行了分析與評價，以期為五味子藥材及復方制劑的質量評價和監管提供一定的參考依據和數據支持。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1100型高效液相色譜儀(Agilent科技有限公司)；AR2140型電子分析天平(上海奧豪斯公司)；METTLER AB135-S十萬分之一電子天平(瑞士)；FW-80 型粉碎機；KQ-250D型數控超聲波清洗器。

1.2 材料 五味子藥材共29批，經遼寧中醫藥大學張慧教授鑒定，均為正品，藥材具體信息見表1。甲醇為分析純；乙腈為色譜純；水為娃哈哈純凈水。五味子醇甲(批號：Y17M8H31887)、五味子醇乙(批號：P28S6F3984)、五味子甲素(批號：Z23J7B16583)、五味子乙素(批號：P25M7F11829)、五味子丙素(批號：P28J8F36961)等均購自上海源葉生物科技有限公司，純度均≥98%。

表1 五味子藥材樣品信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：菲羅門XB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫條件為0～10 min，A為50%；10～15 min，A為50%～75%；15～25 min，A為75%；25～30 min，A為75%～50%。流速：1.0 mL/min；檢測波長：217 nm；進樣體積：10 μL；柱溫：30 ℃，色譜圖如圖1～2所示。

2. 2 混合對照品溶液制備 分別精密稱取各對照品適量，甲醇超聲溶解，得對照品濃溶液。精密吸取一定量的各對照品濃溶液，加甲醇稀釋成含五味子醇甲(0.2048 mg/mL)、五味子醇乙(0.0493 mg/mL)、五味子甲素(0.0984 mg/mL)、五味子乙素(0.0463 mg/mL)、五味子丙素(0.01056 mg/mL)的混合對照品儲備液，備用。

2.3 供試品溶液制備 五味子藥材粉碎，過50目篩，取粉末約0.5 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理30 min，拭干錐形瓶表面放涼，稱重，甲醇補足減失的重量，靜置，取上清液，以0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察 分別精密移取混合對照品儲備液0.1、0.25、0.5、0.75、1 mL，置1 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，精密吸取各混合對照品稀釋液及各單個對照品溶液(樣品中5種木脂素類化合物含量差異懸殊，僅以稀釋后的混合對照品溶液無法滿足整個線性范圍，因此各成分的最高濃度采用單標試驗)各10 μL，注入液相色譜儀，檢測，以對照品的進樣量(μg)為橫坐標，峰面積值為縱坐標，進行線性回歸。具體見表2。

表2 5種木脂素類成分的線性關系結果

成分線性回歸方程r線性范圍/μg 五味子醇甲Y=6311.5X+55.16110.2048～2.56五味子醇乙Y=6497.8X-13.7070.99990.0493～0.61625五味子甲素Y=6569.5X-20.1640.99990.0984～1.23五味子乙素Y=7159.9X-11.6050.99990.0463～0.57875五味子丙素Y=5931.2X+9.30240.99980.01056～0.132

2.4.2 精密度實驗 精密吸取混合對照品儲備液10 μL，依色譜條件連續進樣6次，進行測定，根據峰面積，計算得5種木脂素類成分的RSD分別為0.95%、0.64%、0.79%、1.6%和1.2%，符合規定，儀器精密度良好。

2.4.3 重復性實驗 取同一批次五味子藥材粉末6份(遼寧1批)，各約0.5 g，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，依色譜條件進行測定，根據5種木脂素類化合物的峰面積，計算其在樣品中含量的RSD，分別為1.43%、0.52%、1.24%、1.85%、2.1%，表明該方法重復性良好。

2.4.4 穩定性實驗 取五味子藥材粉末(遼寧1批)約0.5g，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，依色譜條件進行測定。分別于0、2、4、6、8、12 h各進樣10 μL，得峰面積，并計算各成分峰面積的RSD，分別為0.27 %、1.35 %、0.8%、1.64%、2.2%，說明供試品溶液在12 h 內穩定，滿足含量測定要求。

2.4.5 加樣回收率實驗 取已知含量的同一批五味子藥材粉末(遼寧1批)約0.25 g，精密稱定，共6份，分別加入對照品適量，依法制備供試品溶液，依色譜條件進行測定，計算5種成分的平均回收率及RSD，結果顯示，5種木脂素類成分的平均加樣回收率均在99%～100%之間，RSD均小于2%，符合相關規定，表明方法的準確度良好。具體見表3。

表3 5種木脂素類成分的加樣回收率試驗結果

2.5 樣品含量測定 取各批次的五味子藥材(過50目篩)約0.5 g，精密稱定，各2份，依法制備供試品溶液，依色譜條件進行測定，得各化合物的峰面積，根據外標法中的線性回歸方程方法計算樣品中5種木脂素類成分含量。結果見表4。

表4 五味子中5種木脂素類成分含量 (n=2，mg/g)

3 討論

本實驗對多個色譜條件進行考察，包括甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-水，3種梯度洗脫的流動相條件，最終確定乙腈-水的梯度洗脫為本實驗選擇的色譜條件，主要優點是在該色譜條件下樣品中各被測成分的色譜峰與相鄰成分均實現基線分離，色譜峰對稱性良好，且分析時間快，僅需30 min就可以完成整個含量測定過程。同時也考察了不同柱溫(25 ℃、30 ℃、35 ℃)、不同檢測波長(217 nm、254 nm)對實驗結果的影響，結果表明柱溫對待測成分的色譜峰的分離度有影響，當柱溫為30 ℃時，分離度最佳；以254 nm作為檢測波長時，各色譜峰峰形變差，且因各批次藥材中五味子丙素含量均較低，紫外吸收弱，色譜峰響應效果不理想，故選擇色譜峰響應效果、峰形均良好的217 nm作為檢測波長。

在前期材料的準備過程中，藥材均產自五味子的主要產區：遼寧、吉林、黑龍江，29批藥材大部分均收集自東北地區具有代表性的沈陽、哈爾濱的藥材市場，以及在全國具有知名度的亳州、安國藥材市場，既確保了藥材產地的道地性和科學性，又收集了足夠多的樣品，確保了實驗數據的真實、可靠、有代表性。同時對五味子藥材的產地加工、倉儲以及非產地加工、倉儲對藥材質量的影響進行了初步探索，并提供了一定的數據支持。

從表2中可以看出絕大部分樣品中五味子醇甲的含量均≥4 mg/g，符合藥典要求，但是在遼寧、吉林、黑龍江各批次當中各有1批、1批、2批藥材的五味子醇甲含量未達到藥典要求，對這4批藥材研究發現，藥材生產日期均明顯早于其它批次，藥材市場及飲片加工企業在五味子藥材儲藏過程中，出于成本的考慮，倉儲條件可能無法達到國家規定，隨著倉儲時間的延長，五味子藥材受溫度、濕度及蟲蛀的影響，藥材質量會變差[6]，木脂素類成分含量會逐漸降低，因此應當避免使用放置時間過久的陳品，這也是醫院、藥房以及制藥企業采購五味子時需要特別關注的問題。

五味子是遼寧省的道地藥材，又稱“遼五味”，含量測定結果也在一定程度上說明了這一點，29批樣品中，總木脂素含量最高為13.98 mg/g，產自遼寧，且遼寧各批次木脂素含量整體均較高，優于吉林、黑龍江產區的五味子。此外從表4中可以看出，五味子醇甲雖然在5種木脂素類化合物中含量最高，但是另外幾種木脂素類成分的含量也較高，比如五味子醇乙、五味子乙素，其中五味子乙素具有顯著的生物活性，在臨床上應用廣泛[7-8]。這說明單純以五味子醇甲的含量來評價五味子藥材及制劑的質量有所欠缺，應該嘗試以多種指標綜合評價，本實驗為評價五味子中的木脂素類成分提供了一種快速、可靠、科學的檢測方法。

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