HPLC法測定益氣活血通絡顆粒中葛根素的含量

廣東省第二中醫院，廣東 廣州 510095

益氣活血通絡顆粒是我院研制的純中藥制劑，由葛根、黃芪、桂枝、羌活、赤芍、炙甘草等十味中藥以水煎煮提取制備而成，具有舒筋活絡、解痙止痛的功效，臨床上用于治療頸椎病、肩周炎、肌筋膜炎等疾病。葛根為方中君藥，黃芪、桂枝為方中臣藥，現代藥理研究表明，葛根異黃酮是葛根中的主要有效成分，其中葛根素占主體[1]，桂枝具有明顯的鎮痛解痙作用[2]。本研究參照2015版《中國藥典》及文獻方法[3-6]，采用高效液相色譜法對制劑中的有效成分葛根素進行含量測定研究，為控制制劑質量提供實驗依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 1200系列高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；XS205 型電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)。

1.2 材料 益氣活血通絡顆粒(規格: 每袋裝8 g，批號: 20170401、20170506、20170615) 由醫院制劑室提供，葛根素(批號：110752-200912，中國藥品生物制品檢定所)，甲醇為色譜純，水為重蒸餾水，其余試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗 色譜柱: Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水(25∶75)；檢測波長：250 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL，理論板數按葛根素峰計算應不低于4000，葛根素與其他成分分離度符合要求。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取葛根素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含120.96 μg的對照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品適量，研細，取細粉約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入30%乙醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理( 250 W，40 kHz) 30 min，取出，放冷，再稱定重量，用30%乙醇補足減失的重量，搖勻，取上清液，濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 精密吸取不含葛根的陰性樣品，按照供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液，即得。

2.3 專屬性試驗 在2.1項下色譜條件下，分別取對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各10 μL進樣，記錄色譜圖；葛根素保留時間為15.20 min，理論塔板數為5660，主峰與雜質峰的分離度大于1.5，陰性對照在葛根素色譜峰位置處無峰干擾。如圖1所示。

2.4 線性關系 考察分別精密吸取1、2、4、6、8、10 mL葛根素對照品母液至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，分別進樣10 μL，記錄色譜圖；得到峰面積(Y)與進樣量(X)的關系為Y=1.6233X-60.6190，r=0.9999，表明葛根素在0.1210～1.2096 μg 進樣量范圍內線性關系良好。

2.5 精密度試驗 取對照品溶液，精密量取10 μL，連續測定6次，結果峰面積的RSD為0.51% (n= 6) 。

2.6 穩定性試驗 精密吸取供試品(批號:20170401) 溶液10 μL，分別在0、2、4、8、12 h進樣測定一次，結果峰面積的RSD為1.44% (n=6) ，結果表明，供試品溶液在12 h內基本穩定。

2.7 重復性試驗 對同一批樣品( 批號:20170401) 按照供試品溶液制備方法分別制備6份供試品溶液，進樣測定，測得平均含量為2.84 mg/g，其RSD為1.73% (n= 6)。

2.8 加樣回收率試驗 取6 份已知含量的供試品粉末( 批號: 20170401) 0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入一定量的對照品溶液按供試品溶液的制備方法制備供試品，各吸取10 μL 進樣測定，計算回收率，結果平均回收率為101.24%，RSD為1.34% (n=6) 。

表1 益氣活血通絡顆粒中葛根素的加樣回收試驗結果

2.9 含量測定 照上述色譜條件，測定供試品20170401、20170506、20170615中的含量。分別取本品內容物，研細，取細粉約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入30%乙醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理( 160 W，50 kHz) 30 min，放冷，再稱定重量，用30% 乙醇補足減失的重量，搖勻，取上清液，濾過，取續濾液，即得。在相同色譜條件下各進樣10 μL 測定峰面積，計算含量，結果見表1。葛根素的平均含量為2.85 mg/g，RSD均小于2%，表明該含量測定方法穩定可行。

表2 益氣活血通絡顆粒中葛根素的含量測定 (mg/g，n=3)

3 討論

本研究建立了益氣活血通絡顆粒中葛根素含量的HPLC測定法，在提取條件考察過程中，先后考察了幾種常用的提取溶劑和提取方式對本品的提取效果，分別采用甲醇、乙醇和30%乙醇作為提取溶劑考察對葛根素含量提取的影響，結果以30%乙醇為提取溶劑效果最好，其葛根素含量最高；接著考察了回流法及超聲提取法2種方法制備供試液，發現兩種提取方法制備得到的供試品峰面積差異不明顯，考慮到超聲提取法簡單，故選用超聲提取法；還考察超聲提取時間10、30、60 min對葛根素含量的影響，結果表明樣品在超聲提取30 min 后葛根素含量已基本提取完全。故采用30%乙醇超聲30 min提取樣品中的葛根素效果較好。該方法操作簡便，相比藥典中葛根素的含量測定采用加熱回流的方法，可減少檢驗的工作時間，提高檢驗效率。

實驗采用HPLC 法測定該制劑中的主要有效成分葛根素的含量，分離度好。經考察，該方法簡單易行，準確度高，重復性好，可用于測定益氣活血通絡顆粒中葛根素的含量測定，為本制劑的質量標準的制定提供實驗依據。

[1]王愛梅.葛根異黃酮對更年期大鼠學習記憶及抗氧化作用的研究[J].中國現代藥物應用, 2009, 3(24):68-69.

[2]趙耀.桂枝的現代藥理與臨床應用淺議[J].中國中醫藥現代遠程教育,2009,7( 9) : 77.

[3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京:中國醫藥科技出版社,2015: 333．

[4]王希東,郝少君,李文俊,等. 抗眩顆粒的制備及葛根素的含量測定[J].中國藥師, 2014, 17(8):1279-1281.

[5]張金閣. HPLC法測定丹燈通腦片中葛根素的含量[J]. 黑龍江醫藥, 2012, 25(3):350-351.

[6]周曉霞,楊琳,杜靜. HPLC法測定宣肺止咳合劑中葛根素的含量[J]. 中華中醫藥學刊, 2014(7):1694-1696.