清毒提取液對(duì)膿毒癥大鼠腸黏膜屏障功能保護(hù)作用的研究*

宋欠紅 樊 睿 朱虹江 李云華 蘇玉杰 鄧遠(yuǎn)芬 趙 淳

（云南中醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650021）

膿毒癥（sepsis）是臨床難治病、多發(fā)病［1］。 在重癥患者中發(fā)病率高，耗費(fèi)大量醫(yī)療資源。盡管醫(yī)療技術(shù)日漸進(jìn)步，但病死率仍高達(dá)30%~70%［2］。大部分膿毒癥患者臨床表現(xiàn)有發(fā)熱，屬中醫(yī)學(xué)“外感熱病”“溫毒”等范疇［3］。膿毒癥常引起腸道功能紊亂，腸壁充血水腫、壞死、腸黏膜破壞，導(dǎo)致大量?jī)?nèi)毒素釋放入血，引起膿毒血癥［4］。中醫(yī)藥治療膿毒癥可通過多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)發(fā)揮治療作用［5］。清毒提取液是全國(guó)名中醫(yī)趙淳教授治療膿毒癥熱毒蘊(yùn)結(jié)、陽(yáng)明腑實(shí)證的常用方劑，臨床療效顯著。其組方原則主要是根據(jù)膿毒癥主要病機(jī)為菌、毒、炎浸淫三焦，三焦熱盛，熱毒內(nèi)侵，陽(yáng)明腑實(shí)所確定的［6］。本實(shí)驗(yàn)通過觀察清毒提取液對(duì)膿毒癥大鼠小腸組織病理學(xué)改變，及對(duì)血清腸型脂肪酸結(jié)合蛋白（IFABP）、D-乳酸水平的調(diào)節(jié)，探討其對(duì)膿毒癥大鼠腸黏膜屏障功能保護(hù)作用［7-9］，觀察血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT），尿素氮（BUN），肌酐（Cr）水平，研究其對(duì)肝腎功能的保護(hù)作用。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康雄性Wistar大鼠90只，體質(zhì)量 260～300 g，許可證號(hào)：SCXK（滇）2015-0003，大鼠合格證號(hào)：430067000007126，由昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。大鼠自由飲水進(jìn)食，實(shí)驗(yàn)前1周在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：溫度（22±2）℃，濕度40%~70%。

1.2 試藥與儀器 清毒提取液制備，具體組方為生大黃 15 g，炒黃連 15 g，炒黃芩 10 g，黃柏 10 g，梔子15 g［10-11］。 以上 5味，共 10劑劑量。 藥物浸泡 30 min，水煎2次，首煎生大黃后下10 min。加6倍量水，每次煎20 min，2次藥液混勻。減壓濃縮經(jīng)0.2 μm過濾器過濾并調(diào)整質(zhì)量濃度至1 g/mL（按生藥計(jì)算）［12］。由云南中醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院制劑室提供。注射用烏司他汀購(gòu)自廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司。D-乳酸試劑盒購(gòu)自上海新睿生物科技有限公司，IFABP試劑盒購(gòu)自上海晶抗工程有限公司，BUN試劑盒購(gòu)自北京綠源伯德生物科技有限公司，以上3種采用ELISA檢測(cè)。ALT試劑盒購(gòu)自上海朝瑞生物科技有限公司，賴氏比色法檢測(cè)。Cr試劑盒購(gòu)自上海吉如生物科技有限公司，肌氨酸氧化酶比色法檢測(cè)。主要儀器：FA/JA型電子天平（上海方瑞儀器有限公司生產(chǎn)）；723 SPC型分光光度計(jì)（上海奧析科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)）；PSD800型離心機(jī)（蘇州星億機(jī)械有限公司生產(chǎn)）。

1.3 造模與分組 將大鼠用數(shù)字表法隨機(jī)分為6組，分別為假手術(shù)組（n＝10）、模型組（n＝10）、烏司他汀組（n＝10）、清毒提取液低劑量組（n＝20）、清毒提取液中劑量組（n=20）和清毒提取液高劑量組（n＝20）。動(dòng)物模型制作參照陸焱等［16］報(bào)道的方法基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，復(fù)制腹腔感染型膿毒癥大鼠模型。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠。在下腹部正中切長(zhǎng)約2 cm切口，分離盲腸與大腸的系膜，將腸腔內(nèi)糞便擠向遠(yuǎn)端，用滅菌3號(hào)絲線結(jié)扎盲腸，保持腸道通暢。在結(jié)扎范圍內(nèi)用12號(hào)針頭穿刺兩次腸壁，形成腸瘺，兩個(gè)針孔相距約3 mm，為防止傷口愈合在第2針孔內(nèi)放置一條寬2 mm的橡膠引流片。關(guān)閉腹腔，逐層縫合。為補(bǔ)充手術(shù)過程中體液的丟失術(shù)后立即皮下注射生理鹽水，劑量1 mL/100 g體質(zhì)量。假手術(shù)組只打開腹腔，不做盲腸造瘺，然后逐層縫合腹壁。

1.4 給藥方法 清毒提取液成人每日用量為65 g，實(shí)驗(yàn)大鼠與成人用藥量按照成人與大鼠體質(zhì)量比例計(jì)算，方法：成人用量（以體質(zhì)量 70 kg計(jì)）×0.0026×50=大鼠用量/體質(zhì)量（kg）［13-14］。清毒提取液低劑量組、中劑量組、高劑量組分別給予 4.25、8.5、17 mL/kg。于盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)前1 h和術(shù)后24、48、72、84 h分別給大鼠清毒提取液灌胃、0.9%氯化鈉注射液灌胃、烏司他汀靜脈注射。假手術(shù)組和模型組予以0.9%氯化鈉注射液10 mL/kg灌胃。烏司他汀組予以注射用烏司他汀13000 U/kg尾靜脈注射［15］。注射用烏司他汀10萬單位加入0.9%氯化鈉注射液10 mL，使用41/2針頭，左側(cè)尾靜脈注射。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 于盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)后96 h使用10%水合氯醛（2.4 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，待麻醉生效后，將大鼠仰臥位固定。于股動(dòng)脈處取血約3 mL，待血液在試管中自然凝固后，予以離心，取上清液即血清分裝于ependor管置于-20℃冰箱，進(jìn)行檢測(cè)。取回盲部上段3 cm處回腸組織為取材處，剪取回腸腸管長(zhǎng)約1.5 cm，用0.9%氯化鈉注射液將腸管沖洗干凈，用4%多聚甲醛浸泡固定，用于制作石蠟切片。依次使用75%，80%，95%，100%梯度酒精脫水，二甲苯脫蠟、蘇木素-伊紅素染色制作切片標(biāo)本，光學(xué)顯微鏡下觀察病理變化［17］。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，計(jì)量資料采用 t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小腸組織病理學(xué)改變 見圖1。光鏡下可見，假手術(shù)組腸上皮細(xì)胞無破壞，無缺損，小腸黏膜完好，絨毛排布規(guī)整。模型組小腸上皮細(xì)胞有脫落，壞死，連續(xù)性中斷，絨毛排列紊亂，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，毛細(xì)血管出血。烏司他汀組小腸黏膜不完整，腸上皮細(xì)胞有壞死，小腸絨毛增粗，有缺損和斷裂。清毒提取液高劑量組，腸上皮細(xì)胞破壞較模型組輕，小腸絨毛排列欠整齊，有缺損，毛細(xì)血管出血。

圖1 各組小腸組織病理學(xué)改變（HE染色，200倍）

2.2 各組大鼠血清IFABP、D-乳酸水平比較 見表1。清毒提取液低、中、高劑量組與模型組比較，均可以明顯降低IFABP水平（P＜0.05）；清毒提取液中、高劑量組與模型組比較，可以明顯降低D-乳酸水平 （P＜0.05）；清毒提取液低、中、高劑量組與烏司他汀組比較，IFABP、D-乳酸水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組血清IFABP、D-乳酸水平比較（±s）

表1 各組血清IFABP、D-乳酸水平比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05。下同。

組 別 n I F A B P （n g/m L） D-乳酸（m m o l/L）假手術(shù)組 1 0 1 3.0 3±2.2 6 0.5 5±0.0 5模型組 7 2 9.2 8±5.0 5 1.4 7±0.2 2烏司他汀組 1 0 1 8.5 9±3.2 4 0.8 2±0.1 3清毒提取液低劑量組 1 1 1 7.1 1±4.2 2* 1.1 1±0.2 8清毒提取液中劑量組 9 1 7.6 7±3.7 7* 0.7 6±0.1 2*清毒提取液高劑量組 9 1 6.8 9±4.0 1* 0.7 4±0.1 1*

2.3 各組大鼠血清ALT、BUN、Cr水平比較 見表2。清毒提取液低、中、高劑量組與模型組比較，均可以明顯降低ALT水平（P＜0.05）；清毒提取液低、中、高劑量組與模型組比較，可以明顯降低BUN水平（P＜0.05）；清毒提取液低、中、高劑量組與模型組比較，可以明顯降低Cr水平（P＜0.05）；清毒提取液低、中、高劑量組與烏司他汀組比較，ALT、BUN、Cr水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 各組 ALT、BUN、Cr水平比較（±s）

表2 各組 ALT、BUN、Cr水平比較（±s）

組 別 n A L T（U/L）假手術(shù)組 1 0 2 3.7 4±5.5 6模型組 7 1 6 5.3 1±1 6.4 3烏司他汀組 1 0 1 2 3.6 2±1 0.2 4清毒提取液低劑量組 1 1 1 3 0.5 2±1 2.2 8*清毒提取液中劑量組 9 1 3 6.8 7±1 0.7 7*清毒提取液高劑量組 9 1 2 5.3 2±1 1.0 1*B U N（m m o l/L） C r（μ m o l/L）5.7 0±1.0 2 5 3.6 4±6.3 2 1 9.1 1±3.2 3 2 2 1.3 1±1 9.7 6 1 1.0 2±2.2 4 1 4 8.2 5±1 3.4 7 1 0.2 5±2.0 9*1 3 3.8 3±1 2.6 1*1 1.5 4±2.7 4*1 4 0.5 0±1 3.9 9*9.1 8±2.5 5*1 3 6.6 9±1 3.2 5*

3 討 論

膿毒癥所致的腸黏膜破壞，腸壁充血水腫、壞死，是引起腸功能障礙的主要原因。應(yīng)用盲腸結(jié)扎穿孔法復(fù)制的膿毒癥模型，其膿毒癥機(jī)制符合熱毒蘊(yùn)結(jié)陽(yáng)明大腸，陽(yáng)明熱盛、腑實(shí)的特點(diǎn)。因腸道有多種細(xì)菌，形成腸瘺后，細(xì)菌快速繁殖，并產(chǎn)生大量?jī)?nèi)毒素，故膿毒癥發(fā)生急劇、嚴(yán)重。膿毒癥大鼠肝、腎功能受到嚴(yán)重?fù)p傷，是造成死亡的主要原因。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，大鼠死亡分別達(dá)到假手術(shù)組0/10，模型組13/20，烏司他汀組10/20，清毒提取液低、中、高劑量組分別達(dá)到9/20，11/20，11/20，其發(fā)病急，死亡率高，與臨床觀察的發(fā)病狀況相似。

清毒提取液為黃連解毒湯加大黃而成，以大黃、黃連、黃芩、黃柏、梔子按比例（3∶3∶2∶2∶3）組方［18-19］。 不僅瀉火解毒力強(qiáng)，而且有引熱下行之功，使熱邪從大腸而泄，能蕩滌陽(yáng)明熱邪，對(duì)濕熱瘀毒壅滯胃腸有明顯療效，對(duì)減輕腸黏膜損傷有顯著作用。D-乳酸是由腸道內(nèi)多種細(xì)菌如乳酸菌、克雷伯桿菌、大腸桿菌等產(chǎn)生的，正常情況下并不產(chǎn)生該物質(zhì)。當(dāng)腸道黏膜受損時(shí)，血清D-乳酸水平明顯升高，故血清中D-乳酸水平升高程度與腸黏膜損害程度呈正相關(guān)。腸型脂肪酸結(jié)合蛋白能夠反映腸上皮細(xì)胞的通透性，當(dāng)膿毒癥時(shí)，腸黏膜損傷，細(xì)菌移位，腸上皮細(xì)胞通透性增加，腸型脂肪酸結(jié)合蛋白釋放入血，IFABP水平升高。本實(shí)驗(yàn)中清毒提取液中、高劑量組與模型組比較，均可以明顯降低IFABP、D-乳酸水水平，提示清毒提取液能夠改善腸黏膜的損傷，降低腸上皮細(xì)胞的通透性，以減少細(xì)菌、毒素從腸道吸收入血液。模型組ALT、BUN、Cr與假手術(shù)組比較均有數(shù)倍的增高。模型組ALT、BUN、Cr分別為假手術(shù)組的7、3、4倍，表明膿毒癥時(shí)肝腎功能嚴(yán)重受損。而清毒提取液能有效降低ALT、BUN、Cr水平，減輕膿毒癥對(duì)肝腎功能的損害。

清毒提取液組方具有清熱解毒、瀉火攻下，蕩滌濕熱毒邪之功，屬釜底抽薪之法。三黃清解三焦火毒，梔子引邪從小便而出，大黃瀉火攻下，清解陽(yáng)明熱毒，蕩滌濕熱毒邪。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)［20］，黃芩具有解熱、抑菌、抗炎、保肝、抗氧化作用。黃連具有廣泛抗菌作用，有解熱、抗炎、保肝、利膽作用。黃柏具有抗炎、抑菌、抗變態(tài)反應(yīng)作用。梔子具有解熱、抗炎、抗內(nèi)毒素作用。大黃能增加腸蠕動(dòng)、促進(jìn)排便，有抗炎、抑菌、保肝利膽，改善血液循環(huán)，保護(hù)腸屏障功能調(diào)節(jié)免疫作用。其機(jī)理可能是全方發(fā)揮解熱、抑菌、抗炎、抗內(nèi)毒素、保肝、利膽、保護(hù)腸屏障功能調(diào)節(jié)免疫協(xié)同作用的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)初步顯示，清毒提取液是治療膿毒癥的有效方法，能夠減輕腸黏膜損傷，減輕肝腎損傷，防止肝腎功能隨著膿毒癥的加重而進(jìn)一步惡化。其更深入的作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

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