超聲微泡介導沉默T淋巴細胞Itch基因對胃癌MFC細胞免疫殺傷作用的實驗研究

劉丹，張煜，彭莉晴，周靜，鄒慶偉

（西南醫科大學附屬醫院 1.超聲科，2.胃腸外科，四川 瀘州 646000）

胃癌發生率和死亡率占目前全部癌癥例數第二位[1]。胃癌進展與機體免疫水平密切關系，然而針對晚期胃癌的靶向免疫治療至今仍未取得實質進展，如何增強胃癌組織內T淋巴細胞活性將成為胃癌免疫治療關鍵[2-3]。Itch蛋白是一種E3泛素鏈接酶，在調節T淋巴細胞活化和免疫耐受方面起著關鍵作用，其通過調控T細胞受體表達和轉化生長因子-β信號通路以誘導機體免疫耐受[4-5]。敲除Itch基因可增強T淋巴細胞免疫活性和促進Th2細胞因子（IL-4/IL-5）分泌，同時Itch基因敲除小鼠血清IgE和IgG1水平升高，出現嚴重的自體免疫性皮炎病變[6-8]。因此，Itch基因可作為抗腫瘤免疫治療新型靶點用于臨床。RNA干擾（RNA interfere，RNAi）技術是基因研究中一種常用有效工具，但如何將外源基因無創且高效地導入靶細胞內是目前亟待改善的關鍵技術。超聲介導微泡破裂技術（ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD）是一種新型基因定位釋放技術，可為基因靶向治療提供一種簡便、高效、無創的轉染途徑[9]。目前國內外關于Itch抗腫瘤免疫治療應用的報道少見，且未見UTMD介導靶向沉默Itch基因用于胃癌免疫治療的相關研究。本研究擬利用UTMD技術沉默T淋巴細胞Itch基因表達，檢測T淋巴細胞因子IL-2和IFN-γ分泌水平變化，分析轉染T細胞對胃癌MFC細胞的免疫殺傷情況，探索以Itch基因為靶點免疫治療胃癌的可行性。

1 材料與方法

1.1 試劑及設備

615小鼠購于中國科學院（北京）動物實驗中心（許可證號：SHZK（滬）2016-0002），無特定病原體級（SPF級），體重約20～25 g。利用德國美天尼公司免疫磁珠純化脾臟T淋巴細胞，T淋巴細胞純度達96.9%，培養基構成：90%1640培養基，10%胎牛血清，5 μg/ml ConA和1%雙抗。小鼠胃癌MFC細胞起源于615小鼠，購自中國科學院（北京）細胞庫，培養基配置：10%胎牛血清+90% 1640培養基+鏈霉素（100 μg/ml）+青霉素（100 IU/ml）。細胞培養基及耗材購自美國Gibco公司，T淋巴細胞免疫磁珠購自德國美天尼公司，CD3、CD69兔抗小鼠多克隆抗體購自美國BD公司，Itch兔抗小鼠多克隆抗體購自美國Abcom公司，超聲低變頻治療儀器購自Chattanooga公司，SonoVue超聲微泡造影劑購自美國Bracco公司，Itch-shRNA序列合成和質粒構建由上海吉凱基因公司完成，其中質粒攜帶綠色熒光蛋白（green fluorescence protein，GFP）標記基因。

1.2 ShRNA/微泡復合物制備

采用文獻報道Itch-shRNA高效沉默序列[10]，正向：5'-AACCATGACCAATCCGAATAC-3'，反向：5'-AA TGTTAGCCCCAATCGTT-3'，擴增片段長度為256 bp。shRNA質粒合成與構建由上海吉凱基因公司合成，按照說明書操作，將正、反2條核苷酸鏈退火得到雙鏈DNA，T4連接酶定向克隆退火后的shRNA雙鏈模板，包裝至線性化的質粒載體中。隨后，將10 μl ItchshRNA表達質粒與100 μl微泡混合，加入100 μl DMEM培養基中室溫孵化10 min，0.22 μm濾器過濾除菌，備用。

1.3 T淋巴細胞轉染

調節超聲輻照最優參數為1 W/cm2，3 min，20%占空比[11]，超聲探頭置于水槽正下方，探頭上放置12孔板操作平臺，探頭中心正對靶孔。CD3免疫磁珠純化分離小鼠脾臟CD3+T淋巴細胞，離心收集P2代T淋巴細胞，無血清DMEM培養基重懸，以細胞密度1×105/cm2接種至12孔板中。超聲輻照前，3 ml PBS溶液與Sono Vue微氣泡預混合，振蕩或倒置使其分布均勻，微泡密度約為（5～0）×108個/ml，微泡直徑約為2～5 μm。30 μl質粒溶液與100 μl SonoVue微泡懸液充分混勻后，將質粒-微泡混合液置入T淋巴細胞懸液內，予超聲輻照60 s。輻照完成后，從水槽中移出6孔板，37℃細胞培養箱中繼續培養。處理后6 h，更換為10%FBS的1640培養基，繼續培養48 h后離心收集細胞。本實驗設置3個分組，其中實驗組：Itch-shRNA質粒+SonoVue微泡+超聲輻照，對照組：陰性對照shRNA質粒+SonoVue微泡+超聲輻照，空白組：無微泡及超聲輻照處理，另外將GFP質粒按照上訴步驟予以超聲輻照微泡處理，轉染48 h后，流式細胞儀檢測UTMD介導細胞轉染效率，熒光顯微鏡下觀察各分組GFP表達情況。

1.4 Western blot檢測Itch蛋白表達

細胞轉染后繼續培養48 h，1 200 r/min離心5 min，收集細胞后提取T淋巴細胞總蛋白，檢測其中靶蛋白Itch表達水平，80 V直流電壓轉PVDF膜3 h，2%BSA封閉1 h，剪膜，加入1∶800稀釋兔抗鼠Itch多克隆抗體4℃過夜孵育（16～18 h），加入1∶500稀釋HRP標記IgG抗體室溫孵育1 h，在ECL顯色系統中顯色定影，分析雜交條帶。

1.5 流式細胞儀檢測CD69表達

轉染T淋巴細胞24 h后，PBS清洗2次。每組各取1×105個細胞，分別加入PBS溶液100 μl，吸管輕柔吹打均勻，加入1μl兔抗小鼠多克隆CD69抗體，FITC熒光標記，混勻后置室溫避光孵育30 min，PBS清洗3次，800 r/min細胞離心，棄上清液，250 μl PBS溶液重懸，流式細胞儀上機檢測。

1.6 T淋巴細胞免疫殺傷效率測定

轉染T淋巴細胞72 h后，將100 μl實驗組、對照組及空白組T淋巴細胞分別與100μl胃癌MFC細胞混合接種于96孔板，效靶比梯度分別為10∶1、20∶1、40∶1，其中胃癌MFC細胞密度為2×104個/ml，每組設3個復孔。設置單純胃癌MFC細胞為靶細胞組，單純T淋巴細胞作為效應細胞組。細胞共培養72 h，CCK-8法測定細胞殺傷效率。

1.7 腫瘤殺傷率計算方法如下[12]：

1.8 統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊性用LSD-t法檢驗，方差不齊性用Dunnett's T3法檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 T淋巴細胞原代培養

利用免疫磁珠分離C57小鼠脾臟CD3+T淋巴細胞，T淋巴細胞呈橢圓形外觀，懸浮生長，直徑在20 μm左右，流式細胞儀檢測T淋巴細胞表面標志CD3抗原分子表達，證實分離T細胞純度為95.9%。見圖1。

2.2 細胞轉染率測定結果

GFP是一種綠色熒光蛋白，激發后表達綠色熒光，并散在分布于胞質內，熒光顯微鏡下可觀察轉染成功的T淋巴細胞顯示綠色熒光，超聲微泡轉染ItchsiRNA質粒48 h后，本研究利用流式細胞儀檢測T淋巴細胞轉染率達到70.8%。見圖2。

2.3 超聲微泡介導Itch-shRNA質粒轉染對Itch蛋白表達的影響

Western blot檢測UTMD介導Itch-shRNA質粒轉染T淋巴細胞后各組Itch蛋白表達，空白組、對照組和實驗組Itch蛋白相對表達量分別是（0.41±0.09）、（0.39±0.10）和（0.15±0.078），各組Itch蛋白相對表達量比較，差異有統計學意義（F=7.699，P=0.022）。各組總體方差相等，滿足方差齊性，兩兩對比采用LSD法。與對照組比較，實驗組Itch蛋白表達量降低（t=-0.327，P=0.021）；空白組與對照組Itch蛋白表達量比較，差異無統計學意義（t=0.0273，P=0.810），表明超聲微泡介導Itch-siRNA質粒能高效且特異性抑制T淋巴細胞Itch蛋白表達。見圖4。

圖1 T淋巴細胞培養與鑒定

圖2 細胞轉染率測定

圖3 各組Itch蛋白表達

2.4 超聲微泡介導Itch基因沉默后細胞表型CD69表達變化

轉染24 h后流式細胞儀檢測T細胞早期活化標志CD69表達，顯示實驗組CD69表達上調，達到（27.61±3.65）%，對照組和空白組分別為（7.82±1.79）%、（9.33±1.54）%（見圖3），各分組早期活化標志CD69表達比較，差異有統計學意義（F=57.79，P=0.000）。各組總體方差相等，滿足方差齊性，兩兩比較采用LSD法。與對照組比較，實驗組早期活化標志CD69表達增加，差異有統計學意義（t=9.701，P=0.000）；對照組與空白組早期活化標志CD69表達差異無統計學意義（t=-0.737，P=0.489）。由此得知，沉默Itch基因表達后T淋巴細胞表面活化標志CD69表達提高。

2.5 Itch基因沉默可增強T淋巴細胞腫瘤免疫殺傷效率

圖4 轉染24 h后CD69表達

各組總體方差相等，滿足方差齊性，兩兩對比采用LSD-t法。不同效靶比水平（10∶1、20∶1、40∶1）比較，各分組腫瘤殺傷效率比較，差異有統計學意義，其中效靶比水平為10∶1時（F=12.988，P=0.007），與對照組比較，實驗組腫瘤殺傷效率增加（t=4.496，P=0.011）；效靶比水平為20∶1時（F=9.003，P=0.016），與對照組比較，實驗組腫瘤殺傷效率增加（t=4.496，P=0.011）；效靶比水平為40∶1時（F=26.881，P=0.001），與對照組比較，實驗組腫瘤殺傷效率增加，（t=4.496，P=0.011）。此外，隨著效靶比升高，T淋巴細胞對于胃癌MFC細胞殺傷率逐漸增加，當效靶比為40∶1時，實驗組T淋巴細胞殺傷效率最高，達到（45.91±5.65）%。

3 討論

免疫細胞通過關鍵蛋白調節其自身免疫水平而不致過度活化或抑制。Itch蛋白負性調節T淋巴細胞活化因子，如核轉錄因子BAP-1、NF-κb及T細胞表面受體等，誘導機體免疫無反應性，防止機體免疫過度活化[13]。研究證實，特異性T淋巴細胞能浸潤至腫瘤組織內部，然而浸潤T淋巴細胞在腫瘤微環境中處于免疫耐受狀態，無法對腫瘤細胞發動有效免疫攻擊[14-15]。胃癌組織中抗腫瘤免疫應答被調節性T細胞抑制，細胞毒性T細胞活性受損，如能特異性抑制Itch基因表達，則可增強T淋巴細胞免疫反應性以免疫殺傷胃癌細胞。

RNA干擾技術利用小雙鏈RNA誘發同源mRNA高效特異性降解，沉默目的基因表達，是目前常用的分子生物學技術。小干擾RNA（Small interfering RNA，siRNA）和短發夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）是RNAi技術常用的效應片段。具體來講，siRNA的沉默效應是暫時的，而基因載體與shRNA結合后，能實現穩定轉染，誘導靶基因mRNA分解，達到持續抑制效果[16]。本研究選用文獻報道的成熟shRNA序列持續抑制Itch基因表達以便于后續動物實驗研究。將RNAi用于特異性沉默Itch基因之前，首先應解決是基因轉染載體的問題，目前通常采用非病毒或病毒載體。病毒載體轉染效率較高，但存在一定的生物安全隱患，同時病毒自身免疫原性也是實際運用中需要考慮的難題[17]；脂質體和質粒等非病毒載體雖無上述缺陷，但其轉染效率不高，且具有一定的細胞毒性，因此有必要尋找一種新的轉染途徑[18]。UTMD技術利用超聲介導微泡靶向釋放所攜帶基因，可為細胞轉染提供新的途徑，該方法產生細胞空化作用，增加細胞膜通透性，一過性地形成細胞膜孔洞，減小細胞表面不流動層厚度，從而增加轉染效率，本實驗中，UTMD技術轉染48 h后，熒光顯微鏡下可觀察到轉染成功細胞內發出綠色熒光，轉染成功率達51.9%。當然，超聲介導微泡空化轉染基因作為一種物理輔助手段，如果超聲能量強度過大，也可能造成細胞不可逆損傷，甚至導致細胞凋亡和溶解，因此本研究參考既往文獻調整超聲輻照最優參數為1 W/cm2，3 min，20%占空比[11]，可有效避免潛在的細胞損傷發生，有利于確保UTMD介導細胞轉染的安全性。

Itch基因對于T淋巴細胞免疫功能具有負調控作用，本研究首先利用UTMD介導shRNA轉染T細胞以有效沉默Itch基因表達，繼而觀察T淋巴細胞活化程度。CD69分子位于T淋巴細胞表面，靜止的T淋巴細胞不表達CD69分子，而一旦活化，其CD69分子表達數量則上升，因此被認為是T淋巴細胞活化早期標志[19]。實驗結果表明，UTMD轉染48 h后，實驗組CD69表達率升高，這表明UTMD技術能有效抑制Itch基因表達，進而增強T淋巴細胞活性。如何體外評價轉染T淋巴細胞對胃癌MFC細胞免疫殺傷效率是本實驗研究重點。混合細胞培養72 h后，在不同效靶比（10∶1、20∶1、40∶1），實驗組T淋巴細胞較空白組或對照組均具有更高的腫瘤殺傷效率。當效靶比為40∶1時，殺傷效率達到（45.91±5.65%），這表明超聲微泡介導沉默Itch基因能增強T淋巴細胞對胃癌MFC細胞的免疫殺傷作用。

上述研究結果表明，UTMD技術具有較強基因轉染效率，下調Itch基因表達能有效增強T淋巴細胞免疫活性，增強T淋巴細胞對胃癌MFC細胞的體外免疫殺傷作用。

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