保護素DX對膿毒癥小鼠急性肺損傷的保護作用

卜克，王璐，劉林剛

（鄭州大學第五附屬醫院，河南 鄭州 450052）

膿毒癥作為常見的危重癥，是由各種因素導致的的全身炎性反應綜合征，可導致全身各系統、多器官損傷，是危重病房患者主要致死因素[1]。其中，肺往往是最易受損器官，早期便可導致急性肺損傷，且病情進展迅猛，尚無特效的治療方法，病死率較高[2]。因此，如何有效防治膿毒癥所致急性肺損傷，已成為臨床研究重點。研究發現[3]，過度炎癥反應在膿毒癥所致急性肺損傷發生、進展中發揮關鍵性作用。保護素DX（protectin DX，PDX）作為一種ω-3多不飽和脂肪酸代謝產物，近年來研究發現，可減少中性粒細胞中活性氧生成，具有較好的抗炎作用[4]。本研究通過復制小鼠膿毒癥所致急性肺損傷模型，觀察PDX對肺損傷保護作用，并探討可能的機制，以期為膿毒癥所致急性肺損傷臨床防治提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑PDX（購自美國Cayman Chemical公司），HE染色試劑盒（購自北京中杉金橋生物公司），白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）及腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）檢測試劑盒（購自碧云天生物工程公司），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（購自南京建成生物工程研究所），兔抗小鼠核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）多克隆抗體（購自美國SAB公司），兔抗小鼠核因子κB抑制蛋白α抗 原（nuclear factor kappa B inhibitor alpha antigen，IκB-α）多克隆抗體（購自美國Santa Cruz公司）。

1.1.2 實驗動物及分組清潔級健康雄性昆明小鼠45只購自河南省實驗動物中心[合格證號：SCXX（豫）2010-0002]，6～8周齡，體重18～23 g，飼養于標準條件下，自由進食、飲水，利用隨機數字表隨機分為假手術組、膿毒癥組和PDX干預組，每組15只。

1.2 方法

1.2.1 小鼠膿毒癥模型復制按照文獻[5]中的方法復制小鼠膿毒癥模型：用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，取仰臥位，消毒后，取腹正中線切口，將腸系膜和盲腸末端游離，用4號無菌絲線在回盲瓣以下進行結扎，用針頭于盲端部位進行穿孔，擠出少量糞便后，還納腹腔，逐層關閉腹腔，蘇醒后自由進食、飲水。假手術組小鼠僅開腹而不結扎盲腸及穿孔。術畢60 min后，PDX干預組小鼠腹腔注射1 μg的PDX[6]，假手術組和膿毒癥組則給予等量的生理鹽水。實驗過程中膿毒癥組3只小鼠死亡，PDX干預組2只小鼠死亡。

1.2.2 各組小鼠肺組織病理學觀察建模24 h后，各組小鼠處死后，開胸留取右肺組織，4%甲醛固定，石蠟包埋、切片后，行HE染色，光學顯微鏡下觀察肺組織病理學變化，并進行肺損傷評分[7]：根據肺間質水腫、炎癥細胞浸潤、肺泡水腫、肺泡出血、肺不張、透明膜形成病變程度，按照正常、輕度、中度、重度分別按0～3分計分。

1.2.3 各組小鼠肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、SOD、MDA水平檢測取各組小鼠左下肺組織，研磨后制備肺組織勻漿，4℃下3 500 r/min離心15 min，留取上清，保存于-20℃冰箱。利用ELISA檢測血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、SOD及MDA水平，所有操作均在標準實驗室完成。

1.2.4 Western blot檢測肺組織胞核中NF-κB和胞漿中IκB-α蛋白表達取各組小鼠右下肺組織約80 mg，預冷PBS洗滌3次，將核蛋白提取裂解緩沖液加入，置于冰上靜置20 min，勻漿后，將細胞裂解液NP-40加入，于4℃下于12 000 r/min離心40 s，取上清作為胞漿蛋白。沉淀物則用預冷PBS沖洗2次，4℃下于12 000 r/min離心40 s，將核蛋白提取裂解液加入，置于冰上靜置25 min，于4℃下于12 000 r/min離心120 s，取上清作為核蛋白，置于-70℃冰箱冷凍保存備檢。用Bradford法檢測蛋白濃度。取30 μg總蛋白，用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，4℃條件下用濕式轉膜法轉移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫下封閉60 min，TBST液漂洗30 min，分別將一抗兔抗小鼠NF-κB、IκB-α多克隆抗體（稀釋比例1∶1 000、1∶1 200）加入，室溫下靜置60 min，TBST漂洗30 min，加入二抗，TBST漂洗30 min，加入ECL反應液顯影，拍照后，用Image J圖像分析軟件分析條帶獲得胞核中NF-κB和胞漿中IκB-α蛋白相對表達量。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 21.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，行方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠肺組織病理學變化

假手術組小鼠肺組織形態正常，肺泡腔清晰可見，間隔無水腫及炎癥細胞浸潤；膿毒癥組小鼠肺組織間隔增加，間質水腫，有大量炎癥細胞聚集，出現肺泡腔融合，腔內出現有點狀或片狀出血；PDX干預組小鼠肺組織病變較膿毒癥組減輕，見圖1。

2.2 各組小鼠肺組織損傷嚴重程度組織學評分

假手術組、膿毒癥組和PDX干預組小鼠肺組織損傷組織學評分分別為（2.4±1.0）、（13.7±1.3）及（6.4±1.6）分，與假手術組比較，膿毒癥組和PDX干預組小鼠肺組織損傷組織學評分均升高，與膿毒癥組比較，PDX干預組小鼠肺組織損傷組織學評分則降低，差異有統計學意義（F=253.323，P=0.000）。

2.3 各組小鼠肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、SOD及MDA水平比較

假手術組、膿毒癥組和PDX干預組小鼠肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、SOD及MDA水平差異有統計學意義（F=1980.915、141.627、62.851、44.720及78.345，均P=0.000），兩兩比較，與假手術組比較，膿毒癥組和PDX干預組小鼠肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、SOD及MDA水平均升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與膿毒癥組比較，PDX干預組小鼠肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、SOD及MDA水平均降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

2.4 各組小鼠肺組織胞核中NF-κB和胞漿中IκB-α蛋白表達比較

假手術組、膿毒癥組和PDX干預組小鼠肺組織胞核中NF-κB和胞漿中IκB-α蛋白相對表達量比較差異有統計學意義（F=55.675和123.909，均P=0.000）；兩兩比較，與假手術組比較，膿毒癥組和PDX干預組小鼠肺組織胞核中NF-κB蛋白相對表達量均升高，而胞漿中IκB-α蛋白相對表達量均降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；與膿毒癥組比較，PDX干預組小鼠肺組織胞核中NF-κB蛋白相對表達量均降低，而胞漿中IκB-α蛋白相對表達量均升高，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2和圖2。

圖1 各組小鼠肺組織病理學變化 （HE×200）

表1 各組小鼠肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、SOD及MDA水平比較 （±s）

表1 各組小鼠肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、SOD及MDA水平比較 （±s）

注：1）與假手術組比較，P ＜0.05；2）與膿毒癥組比較，P ＜0.05

組別 例數 IL-1β/（pg/mg） IL-6/（pg/mg） TNF-α/（pg/mg） SOD/（u/mg） MDA/（nmol/mg）假手術組 15 47.1±4.0 110.2±39.5 88.1±17.1 32.5±6.9 5.7±1.4膿毒癥組 12 159.5±5.91） 359.5±20.51） 158.6±19.31） 59.0±9.21） 14.8±1.91）PDX 干預組 13 74.4±4.31）2） 162.4±51.31）2） 115.1±11.71）2） 38.7±6.21）2） 8.6±2.31）2）F值 1980.915 141.627 62.851 44.720 78.345 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表2 各組小鼠肺組織胞核中NF-κB和胞漿中IκB-α蛋白表達比較 （±s）

表2 各組小鼠肺組織胞核中NF-κB和胞漿中IκB-α蛋白表達比較 （±s）

注：1）與假手術組比較，P ＜0.05；2）與膿毒癥組比較，P ＜0.05

組別 例數 NF-κB蛋白 IκB-α蛋白假手術組 15 0.31±0.07 0.98±0.15膿毒癥組 12 0.77±0.121） 0.30±0.071）PDX 干預組 13 0.51±0.141）2） 0.63±0.091）2）F值 55.675 123.909 P值 0.000 0.000

圖2 各組小鼠肺組織胞核中NF-κB和胞漿中IκB-α蛋白表達

3 討論

膿毒癥作為燒傷、創傷、外科手術及缺血再灌注損傷等常見嚴重并發癥，是導致患者死亡的重要因素[8]，研究表明[9]，膿毒癥所致難以控制的全身炎癥反應，最終導致的多器官損傷是導致患者早期死亡的主要原因。肺作為發生膿毒癥時最易受損的靶器官，近年來雖然各種診療技術不斷進步，但膿毒癥所致急性肺損傷仍是主要死亡原因[10]，是目前危重醫學亟需解決的難題。有研究指出[11]，膿毒癥引發的全身炎癥及大量炎癥因子釋放導致的氧化/抗氧化失衡是發生急性肺損傷的主要因素。PDX作為多不飽和脂肪酸經脂氧合酶代謝產物，在減少炎癥反應及相關細胞因子釋放中發揮重要作用[12]，戴昳寧[13]指出，PDX可降低叔丁基過氧化氫誘導的炎癥及炎癥相關細胞因子釋放，減輕視網膜色素上皮細胞氧化損傷。本研究利用文獻[5]中經典方法構建膿毒癥所致小鼠急性肺損傷模型，病理學檢查結果顯示，膿毒癥組小鼠肺組織出現典型的急性損傷改變，且肺組織損傷組織學評分顯著增加，表明成功構建膿毒癥所致小鼠急性肺損傷模型。

IL-1β、IL-6及TNF-α作為機體內主要的促炎因子，其水平與體內炎癥反應水平呈正相關，可反應機體炎癥反應水平[14]，MDA作為脂質過氧化反應產物，是反應機體內氧自由基生成及活性的主要指標，而SOD作為一種保護性物質，則在保護細胞免受氧自由基損傷中發揮重要作用[15]。本研究顯示，與假手術組比較，膿毒癥組和PDX干預組小鼠肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、SOD及MDA水平均升高，說明膿毒癥所致急性肺損傷時，肺組織發生氧化應激和炎癥反應，而在給予PDX干預后，小鼠肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、SOD及MDA水平均降低，說明PDX可減少小鼠肺組織中炎癥因子及氧化應激反應，病理學檢查亦顯示，PDX干預組小鼠肺組織病變較膿毒癥組減輕，且肺組織損傷組織學評分降低，進一步說明PDX可通過抑制小鼠肺組織炎癥及氧化應激反應而減輕膿毒癥所致急性肺損傷。

有研究指出[16]，NF-κB可通過調控炎癥因子釋放而參與急性肺損傷發生。正常情況下，未活化的NF-κB與抑制蛋白IκB結合而游離于胞漿中，當受到外界刺激時，IκB發生降解而與NF-κB解離，NF-κB快速移至細胞核內，在于特異性靶位結合后，促進多種炎癥因子和介質大量釋放[17]。本研究顯示，與假手術組比較，膿毒癥組和PDX干預組小鼠肺組織胞核中NF-κB蛋白相對表達量均升高，而胞漿中IκB-α蛋白相對表達量均降低，說明發生膿毒癥時可導致肺組織胞漿中IκB-α蛋白解離而使胞核中NF-κB蛋白大量增加，引發炎癥反應，從而導致肺組織發生急性損傷，而在給予PDX干預后，PDX干預組小鼠肺組織胞核中NF-κB蛋白相對表達量均降低，而胞漿中IκB-α蛋白相對表達量均升高，說明PDX可能通過減少胞漿中IκB-α蛋白降解而阻止胞核中NF-κB蛋白，從而減輕炎癥因子釋放，發揮肺保護作用。

綜上所述，PDX可減輕膿毒癥所致小鼠肺組織損傷，其機制與減輕氧化應激反應及通過調控NF-κB/IκB-α通路而抑制炎癥因子釋放有關。

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