MicroRNA聯合TCT、HC2-HPV檢測高危人乳頭瘤病毒對早期宮頸癌的診斷價值

李永杰，王琛

（河南大學淮河醫院 婦產科，河南 開封 475000）

宮頸癌臨床較常見，呈現出癌變重、發現晚及病亡率高等特征，在女性惡性腫瘤中居第2位，僅次于乳腺癌，已經嚴重危害女性健康。宮頸癌病變的主要危險因素是高危型人乳頭狀瘤病毒（high risk type human papilloma virus，HR-HPV）長期感染誘發[1]。近幾年相關研究顯示，99%以上的宮頸癌患者主要病因發生發展是HR-HPV感染所致。目前，薄層液基細胞學檢查（thinprep cytology test，TCT）在宮頸癌的診斷、治療等方面得到普遍應用，成為篩查宮頸癌的常規方法[2]。而第2代雜交捕獲試驗（hybrid captureⅡ，HC2）能夠對宮頸管代謝物HR-HPV及癌前病變實施有效臨床分析檢測，由于宮頸癌的發生、發展過程時間較長，在癌前病變期若能夠盡早發現并盡早治療，可以有效預防其惡化，提高患者的生存率，故宮頸癌的早期篩查十分重要[3]。同時，HC2-HPV-DNA檢測結果可能因某些基因蛋白特異性表達而不能達到常規儀器檢測或癌變征兆，易發生漏診。而隨著近些年分子生物學與基因遺傳學的發展，發現血清標志物微小RNA（MicroRNA）與宮頸癌進展存在緊密聯系，且有細胞特異性，參與癌細胞的增殖、分化及凋亡等周期過程，實時調控癌基因活性發揮關鍵的生物學作用[4]。故Micro RNA聯合TCT、HC2-HPV-DNA基因檢查，成為婦女宮頸疾病方面較為前沿的診斷技術，具有較高的敏感性與特異性[5]，而目前相關方面報道較少。故本文對來我院婦產科門診就診的疑似宮頸癌患者進行臨床分析，旨在研究Micro RNA、TCT與HC2-HPV基因檢查對早期宮頸癌篩選的臨床應用價值，提高早期診斷率，為臨床提供一定的參考指標。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年2月-2016年2月本院就診的疑似宮頸癌患者150例作為觀察組。平均年齡（35.26±5.32）歲，所有患者均在知情且自愿的情況下并通過倫理委員會參加本研究。對宮頸肥大、潰瘍或糜爛等不同程度癥狀表現的患者實施TCT、MicroRNA、HC2-HPV檢測與宮頸病理活檢。

1.2 方法

MicroRNA提取：采集研究對象宮頸樣本，依照Trizol試劑盒標準嚴格實施每一步，所得mRNA A260/280調節1.8以上。Real-time PCR反應：依照Access RTPCR System嚴格操作，并依據GenBank設計對應序列引物（a為正向引物，b為反向引物）：MicroRNA-203-Fa GTGAAATGTTTAGGACCACTAGAA，Micro RNA-203-Rb GCTGTCAACGATACGCTACGT；U6 RNA-Fa CGCTTCGGCAGCACATATAC，U6 RNA-Rb TTCACGAATTTGCGTGTCAT。其中，將cDNA、引物和SYBR Green混合，Real-time PCR條件為：95℃預變性5 min，后95℃變性10 s 60℃退火，72℃延伸20 s，共40個循環。Real-time PCR使用Applied Biosystems 7000擴增儀進行。所有樣品做3復孔，記錄每個反應管中的熒光信號到達所設定的域值時所經歷的循環數即Ct值，以U6作為內參照，采用定量PCR中的相對定量法，以2-ΔΔCt表示目的miRNA的表達相對于內參的變化倍數，其中Δ△Ct=Ct-miRNA-CtU6。

TCT：嚴格按照TCT取樣要求制成薄層涂片，經巴氏染色后送到病理科檢測。宮頸細胞學診斷根據國際癌癥協會核定的貝塞斯達系統（the Bethesda system，TBS）分類標準[6]，根據細胞異型性的嚴重程度依次診斷為正常范圍（normal range，NR）、意義不明的不典型鱗狀細胞（atypical squamous cells of undermined significance，ASCUS）、低度鱗狀上皮內病變（low grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）、高度鱗狀上皮內病變（high degree of squamous intraepithelial lesion，HSIL）、鱗狀細胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）和腺癌。將≥ASCUS診斷為陽性。

HC2-HPV-DNA檢測：采用美國Digene公司提供的HPV-DNA技術進行嚴格制樣并檢測，13種高危型 HPV（16、18、3l、33、35、39、45、5l、52、56、58、59、66與68），判斷標準：相對光單位（relative light unit，RLU）/Cutoff（閾值）≥1.0診斷為HPV陽性。

病理組織活檢[7]：操作醫師在陰道鏡下對可疑位多點活檢，將組織送病理科檢測。根據2013版《病理學》子宮頸腫瘤組織學標準：良性細胞改變（benign cell change，BCC）、不典型增生輕度（cervical intraepithelial neoplasia-I，CIN-I）、 中 度（cervical intraepithelial neoplasia-Ⅱ，CIN-Ⅱ）、重度（cervical intraepithelial neoplasia-Ⅲ，CIN-Ⅲ）及SCC。病變在CIN-Ⅰ及以上為組織學陽性。

1.4 評定指標

根據病理學診斷結果為金標準，計算TCT、HC2-HPV及MicroRNA相對表達量的敏感性、特異性及診斷符合率。

1.5 統計學方法

數據分析采用SPSS 16.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗；計數資料用率（%）描述，并行χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TCT診斷結果與病理學結果比較

TCT診斷結果（NR、ASCWS、LSIL、HSIL、SCC）與病理學結果（BCC、CIN-I、CIN-II、CINIII、SCC）比較，差異有統計學意義。TCT診斷結果≥ASCUS有73例（73/150）呈陽性，占48.67%，病理學結果≥CIN-I有79例（79/150），占52.67%。見表1。

2.2 HC2-HPV診斷結果與病理學結果比較

不同病理學診斷結果（BCC、CIN-Ⅰ、CIN-Ⅱ、CIN-Ⅲ、SCC）與HC2-HPV陽性率差異較大，且其隨宮頸癌變嚴重程度逐漸升高，比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 MicroRNA相對表達量與病理學結果比較

不同病理學診斷結果（BCC、CIN-Ⅰ、CIN-Ⅱ、CIN-Ⅲ及SCC）與不同microRNA相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05），miRNA-21與miRNA-193b表達量隨宮頸癌變嚴重程度逐漸升高，表明其有促進癌變周期發生、發展；而miRNA-124與miRNA-195表達量隨宮頸癌變嚴重程度逐漸降低，表明其有抑制癌變周期發生、發展。血清microRNA相對表達量的檢測可以直接預估宮頸癌變情況，有直接指導價值。見表3。

表1 TCT診斷結果與病理學結果比較 例（%）

表2 HC2-HPV診斷結果與病理學結果比較 例（%）

2.4 患者TCT與HC2-HPV診斷結果比較

HC2-HPV陽性率隨宮頸癌變嚴重程度逐漸升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表4。

2.5 MicroRNA相對表達量、TCT、HC2-HPV檢測對宮頸癌患者診斷結果比較

MicroRNA聯合TCT、HC2-HPV檢測的敏感性為98.73%，特異性為98.59%，高于單項microRNA、TCT、HC2-HPV或者聯合microRNA+TCT、HC2-HPV+TCT及microRNA+HC2-HPV的比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；同時microRNA聯合TCT、HC2-HPV檢測的診斷符合率為98.67%，也優于單項或者兩項聯合（P＜0.05）。此外，microRNA的敏感性、特異性及診斷符合率優于單一TCT、HC2-HPV的。見表5。

表3 MicroRNA相對表達量與病理學結果比較 （u/ml，±s）

表3 MicroRNA相對表達量與病理學結果比較 （u/ml，±s）

注：1）與BCC比較，P ＜0.05；2）與CIN-Ⅰ比較，P ＜0.05；3）與CIN-Ⅱ比較，P ＜0.05；4）與CIN-Ⅲ比較，P ＜0.05

項目 BCC CIN-Ⅰ CIN-Ⅱ CIN-Ⅲ SCC F值 P值miRNA-21 121.32±10.32 135.26±15.571） 226.31±29.251）2） 334.13±37.461）2）3） 411.45±43.641）2）3）4） 752.611 0.000 miRNA-124 106.52±13.21 81.36±8.371） 67.37±6.381）2） 51.25±5.721）2）3） 39.35±5.121）2）3）4） 191.492 0.000 miRNA-193b 104.13±12.35 129.42±15.571） 151.38±24.231）2） 192.46±32.371）2）3） 245.58±39.691）2）3）4） 175.880 0.000 miRNA-195 92.79±9.48 77.25±7.351） 61.21±6.421）2） 45.26±5.531）2）3） 36.36±4.791）2）3）4） 229.085 0.000

表4 患者TCT與HC2-HPV診斷結果比較 例（%）

表5 MicroRNA相對表達量、TCT、HC2-HPV對宮頸癌患者診斷結果比較 例（%）

3 討論

宮頸癌防治重點是在早期宮頸癌前病變進行有效篩查并采取合理的治療與預防措施。隨著醫療技術的不斷進步以及人們保健意識的提高，大多數生育期女性的初期官頸癌可以被及時診斷。早期普遍采用TCT技術可以提高宮頸上皮內瘤變的診斷率，具有較高的敏感性與特異性[8]。本研究結果顯示，TCT診斷（NR，ASCUS、LSIL、HSIL、SCC）與病理學結果（BCC、CIN-Ⅰ、CIN-Ⅱ、CIN-Ⅲ及SCC）比較有差異。TCT診斷結果≥ASCUS呈陽性占48.67%，病理學結果≥CIN-I占52.67%，說明單一的TCT診斷存在一定的陽性預測率，但預測值較低，故容易出現漏檢、假陰性情況[9]。有研究表明，高危型HPV感染往往與宮頸癌變密切相關，而HC2-HPV具有簡便易行，較高的HPV陰性預測率也被逐漸采用[10]。本研究結果顯示，不同病理學診斷結果與HC2-HPV陽性率差異較大，且其隨宮頸癌變嚴重程度逐漸升高，有差異。其中HC2-HPV陰性率較高，與以上報道一致。有研究顯示，HC2-HPV與TCT可提高陽性檢出率，降低漏檢[11]。此外，本研究進一步分析HC2-HPV與TCT診斷結果，發現HC2-HPV陽性率隨宮頸癌變嚴重程度逐漸升高，比較有差異，進一步揭示宮頸癌早期采用HC2-HPV與TCT有一定診斷效果。此外，研究報道證實，microRNA在HPV活性周期中發揮關鍵調控作用，具有下調抑癌基因表達及癌細胞增殖作用，且與宮頸癌細胞分化、轉移有直接聯系[12]。本研究結果顯示，不同病理學診斷患者中不同microRNA相對表達量有差異，miRNA-21與miRNA-193b表達量隨宮頸癌變嚴重程度逐漸上升，表明其有促進癌變周期發生、發展[12]；而miRNA-124與miRNA-195表達量隨宮頸癌變嚴重程度逐漸下降，表明其有抑制癌變周期發生、發展。血清microRNA相對表達量的檢測可以直接預估宮頸癌變情況，有直接指導價值[13]。

另外，有研究報道證實，microRNA聯合TCT、HC2-HPV基因檢測可以有效提高診斷的準確率和敏感性[14-15]。本研究結果顯示，新型腫瘤標志物micro RNA的敏感性、特異性及診斷符合率優于單一TCT、HC2-HPV。同時microRNA聯合TCT、HC2-HPV檢測的敏感性為98.73%，特異性為98.59%及診斷符合率為98.67%，高于單項microRNA、TCT、HC2-HPV兩種或者聯合如microRNA+TCT、HC2-HPV+TCT及microRNA+HC2-HPV，比較有差異。揭示聯合應用可以更加準確診斷早期宮頸癌情況，采用聯合方法診斷結果可優勢互補，在臨床宮頸癌前期病變診斷方面應大力推廣[16-17]。

綜上所述，采用microRNA聯合TCT、HC2-HPV，用于宮頸癌患者的診斷及病情評估，具有較高的敏感性、特異性及診斷符合率，在臨床有較高的診斷價值。

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