人用H5N1禽流感疫苗臨床研究進展

王月琦 （北京師范大學亞太實驗學校 北京 102209）

禽流行性感冒（禽流感）是由禽流感病毒引起的一種禽類烈性傳染病。禽流感病毒的某些亞型毒株會感染人類而引起急性呼吸道傳染病，稱為人感染禽流感（人禽流感）。與普通流行性感冒（流感）相比，人禽流感致病性強，致死率高，且缺乏有效的疫苗控制預防。

H5N1 亞型禽流感病毒具有高致病性，可感染人類。人感染H5N1 禽流感病毒后伴有嚴重的并發癥，致死率高達60%以上。自從1997年在香港首次發現H5N1 禽流感病毒由家禽傳染人類的病例以來，全世界多個國家和地區均出現確診病例，H5N1 流感病毒呈現出世界性分布態勢。泰國一例母親與兒童之間的傳播加劇了人們對H5N1 禽流感大流行爆發的擔憂。因此對于H5N1 禽流感的防治一直是相關科研工作者研究的重點。

接種疫苗是預防禽流感病毒傳播的有效方法，可以大大降低發病率和死亡率。目前市場上常見的人用禽流感疫苗主要是全病毒滅活疫苗和裂解疫苗。然而這2 種疫苗都是由雞胚中培養產生的病毒株制備而成，制備工藝復雜耗時長，難以滿足禽流感大流行時人們對疫苗的大量需求；疫苗成分復雜，有卵清蛋白等物質的殘留，對蛋類過敏的人群不適合接種這2 類疫苗。另外，野生型H5N1 高致病性流感病毒毒力較強，會對活性的雞胚產生破壞，不適合采用上述傳統方式制備H5N1流感疫苗，因此，開發新型的人用H5N1 禽流感疫苗制備技術成為研究熱點。本文綜述現階段各國家的人用H5N1 禽流感疫苗進入臨床研究及臨床審批情況的相關進展，并介紹各類型人用禽流感疫苗的臨床數據及關鍵技術，可為人用禽流感疫苗或其他針對高致病性病毒的疫苗研發提供參考依據。

1 禽流感滅活疫苗

滅活疫苗是在雞胚中培養并收集純化流感病毒，用甲醛溶液或β-丙內酯滅活得到。根據滅活純化工藝的不同，滅活疫苗又分為全病毒滅活疫苗、裂解疫苗和亞單位疫苗；根據選擇的毒株的不同，可以分為自然分離株滅活疫苗和重配病毒株滅活疫苗。

1.1 H5N1 病毒株的選擇 野生型H5N1 流感病毒具有高致病性，會對雞胚的活性產生嚴重危害，雞胚培養難以獲得足夠量的病毒生產疫苗。為攻克這一技術難題，研究人員采用反向遺傳技術構建了重配H5N1 病毒株，提高了毒株的安全性及在雞胚中的生長能力。這些重配病毒株保留了H5N1 流感病毒HA 與NA 的抗原性，同時加入了高產流感株A/Puerto Rico/8/34（H1N1；PR8）的相關基因。PR8 流感病毒對人體無致病性，且在雞胚中易于生長，PR8 毒株已被用來生產H1N1 和H3N2 等季節性流感疫苗。目前世界衛生組織（WHO）推薦的重配H5N1 病毒株主要是英國國家生物品標準化與檢定研究所（NIBSC）研發的NIBRG-14 （A/Vietnam/1194/2004-A/PR/8/34） 流 感病毒毒株。

1.2 全病毒滅活疫苗 H5N1 全病毒滅活疫苗已被批準生產應用。在我國，北京科興生物制品有限公司采用NIBRG-14 毒生產了H5N1 禽流感全病毒滅活疫苗，疫苗以氫氧化鋁作為佐劑，血凝素（HA）含量為10 滋g/0.5 mL /支，在2008年獲得了國家食品藥品監督管理總局（SFDA）的生產批件。該疫苗適用于18～60 歲人群的預防接種，免疫后42 d 志愿者血清陽轉率達到78%，抗體指標均達到歐盟人用醫藥產品委員會（CHMP）發布的流感疫苗的免疫標準［1］；并且，交叉免疫研究結果顯示： 臨床試驗用的越南株疫苗對于安徽株和印尼株具有較好的交叉免疫反應。

匈牙利Omninves 公司生產的H5N1 全病毒流感疫苗同樣以NIBRG-14 為生產毒株，每針劑含有HA 6 滋g/0.5 mL，并采用AlPO4為佐劑，以單針劑的全病毒滅活疫苗接種志愿者（146 人，＞18 歲），血清保護率約有68%［2］。該疫苗獲得匈牙利批準生產，但由于該公司未提供詳細數據未獲得歐盟審批許可。

在安全性評價中發現，H5N1 全病毒滅活疫苗的常見的不良反應是注射部位紅腫疼痛，全身乏力等，這與疫苗制備過程中引入的雜質（卵清蛋白、裂解劑和硫化汞等）有關，一般適用人群為18～60歲對雞蛋無過敏史、非妊娠期的成人。由于全病毒滅活疫苗如果滅活不徹底具有潛在的致病性，生產過程中需要謹慎評估疫苗的抗原反應性。

1.3 裂解疫苗與滅活型亞單位疫苗 與全病毒滅活疫苗相比，裂解疫苗引起的副反應較小，具有較高的安全性。裂解疫苗是利用乙醚等裂解劑去除流感病毒中的脂類成分，保留病毒的所有蛋白成分，病毒的顆粒結構和單鏈RNA 幾乎丟失，因此裂解疫苗的固有免疫原性也相應減小，接種一般需要2 針劑免疫，且需要提高抗原用量或加入佐劑增強疫苗的抗原性。流感裂解疫苗制備相對簡單，已被廣泛應用于三價季節性流感疫苗中，人用H5N1 禽流感裂解疫苗也已被批準生產。

賽諾菲巴斯德研究所以NIBRG-14 為毒株生產出H5N1流感裂解疫苗，臨床試驗顯示［3］，2 針高劑量的抗原HA（90 滋g）含量誘導產生更高水平的血清抗體，加入鋁佐劑組后，保護性抗體顯著提高。賽諾菲巴斯德研究所在二免6 個月后又進行了第3 次免疫，結果發現抗體滴度大大提高，然而考慮到流感大流行時的時間與經濟問題，3 次免疫并不是合適的免疫策略。2007年4月，賽諾菲巴斯德研究所生產的含抗原HA 90 滋g 的劑型（不含佐劑）通過FDA 批準，適用人群為18～64 歲的健康人群。英國葛蘭素史克（GSK）公司也發現低于90 滋g HA 的抗原劑量難以達到免疫保護效果［4］。然而該劑量是常規季節性流感疫苗劑量的6 倍，現有的傳統疫苗生產力在流感流行期間難以滿足疫苗用量需求。

澳大利亞CSL 公司生產的H5N1 裂解疫苗在2008年6月在澳洲注冊成功。臨床試驗為30 滋g和45 滋g HA 含佐劑組受試人群包括6 個月～9 歲的健康嬰兒和兒童、18～64 歲健康成人和大于65歲的健康老人，結果發現6 個月～9 歲的嬰兒和兒童組產生較好的免疫反應［5］。但由于巴斯德所被批準的H5N1 裂解疫苗的存在，CSL 公司的裂解疫苗在隨后的FDA 注冊中未能通過。

滅活流感亞單位疫苗是在裂解疫苗的基礎上經過分離純化制備而成，主要成分是HA 與NA等抗原蛋白，抗原純度高，疫苗成分簡單，安全性好。與流感裂解疫苗相似，亞單位疫苗的免疫原性較弱，應用時同樣需要加入佐劑，且生產成本較高。瑞士諾華（Novartis）公司的臨床試驗，試驗以氫氧化鋁和水包油乳劑MF59 為佐劑［6］。結果發現，7.5 滋g HA 的疫苗劑量輔以MF59 所誘導的抗體反應最強，血清陽轉率為73%；而鋁佐劑組即使HA 含量上升至30 滋g 時，志愿者的血清陽轉率也僅為14%。同樣，英國GSK 公司發現油乳佐劑AS03 對H5N1 滅活疫苗的免疫原性提高效果也遠優于鋁佐劑［7］。

以上臨床試驗結果中可以發現，H5N1 禽流感病毒中血凝素H5 的免疫原性遠弱于其他類型的流感病毒，因此加入安全有效的佐劑以提升滅活型H5N1 疫苗制劑的免疫原性成為科研工作者的研究熱點。

1.4 基于細胞培養的流感滅活疫苗 雞胚培養的流感疫苗制備工藝復雜、周期長且產量有限，在流感大流行期間難以迅速生產大量疫苗。因此，相關科研人員嘗試尋找新的策略生產流感疫苗。以細胞培養代替雞胚培養可以縮短疫苗生產周期，在生產過程中易于控制質量參數，更有利于大規模生產疫苗，同時可以解決雞胚培養時卵清蛋白殘留帶來的問題，所生產的疫苗可以用于對雞蛋過敏人群的接種。目前馬犬腎細胞系（Madin－Darby canine kidney cells，MDCK）和非洲綠猴腎細胞系（African green monkey Vero cells，Vero）在荷蘭已經得到許可生產流感疫苗。而在世界范圍內只有Vero細胞可用于疫苗生產。美國百特（Baxter）公司［8］采用Vero 細胞培養生產的H5N1 全病毒滅活疫苗（VepacelR）已經進行了Ⅲ期臨床試驗，發現受試者疫苗保護率顯著高于雞胚培養的流感疫苗受試者，并且疫苗的安全性與耐受性均提高，該疫苗于2012年獲得歐盟批準上市。

雞胚培養生產疫苗具有有效、安全、產量較高等優勢，然而在生產新的疫苗之前，需要對病毒種子進行篩選，并不是每種病毒株都適合雞胚培養。另外，雞胚培養的周期較長，在流感大流行時期可能無法及時滿足疫苗需求。細胞培養生產的疫苗周期短，但擴大生產需要重新優化工藝，小量生產時的工藝條件不適用于大的發酵罐，另外細胞培養容易偶發污染，造成資源浪費，因此近些年有些廠家放棄了細胞培養回歸到雞胚培養。總體來講，兩者成本及生產的疫苗質量不相上下，然而對于發展中國家，在雞胚培養上進行重點投資比較合適。

2 減毒活疫苗

為了提高疫苗的免疫原性、降低抗原用量，研究人員開發了生產成本低、 周期短的冷適應性流感減毒活疫苗。冷適性減毒活疫苗保留了流感病毒的部分抗原活性，通過模擬病毒的自然感染途徑刺激機體，可以誘導產生長效免疫反應。通過滴鼻或噴鼻接種人群后，減毒活疫苗可以有效誘導機體產生黏膜性sIgA 抗體，并能誘導較好的細胞免疫反應，具有一定的交叉保護能力。然而減毒活疫苗也存在很多需要克服的問題：1）由于病毒在鼻咽部的復制，減毒活疫苗引起的常見不良反應包括鼻塞、頭痛、肌肉疼痛或發熱；2）減毒活疫苗存在毒力回復的可能，需要對其生物安全性進行充分驗證；3）出于安全性考慮，減毒活疫苗不能應用嬰兒或老年人等高危人群；4）為防止新的HA 和NA 的基因插入人類基因組，減毒活疫苗只能在已知病毒株流行期間應用；5）基于雞胚培養的生產方法限制了減毒活疫苗的生產力。

Karron［9］等制備了H5N1 流感減毒活疫苗，在臨床試驗中該疫苗的安全性得到了驗證，H5N1 減毒活疫苗在鼻腔中的復制十分有限，毒性明顯弱于季節性流感減毒活疫苗。臨床前實驗表明，2 次鼻腔免疫H5N1 減毒活疫苗可以有效抑制同型或異型流感病毒的復制生長，為機體提供交叉保護力。然而，在臨床實驗中［10］，該疫苗的保護效果并不理想，經僅11%的志愿者體內檢測到具有保護性的抗體，這可能與疫苗毒性過低有關。

俄羅斯也批準了一例人用H5N2 流感減毒活疫苗［11］，臨床試驗中血清陽轉率為47%～55%，對以反向遺傳技術制備的重配H5N1 流感病毒株具有交叉保護力，保護率約為29%～31%。該疫苗可以有效誘導鼻腔黏膜分泌抗體，并可提高志愿者外周血中的CD4 和CD8 效應/記憶性T 細胞的水平。

3 重組亞單位疫苗

流感重組亞單位疫苗（recombined HA，rHA）是將流感病毒的抗原蛋白（主要是血凝素HA）的基因載入桿狀病毒系統通過表達、純化制備而成。所采用的表達系統包括哺乳動物細胞、昆蟲細胞、大腸埃希菌、 酵母和植物等。重組亞單位疫苗中HA 是否能夠正確折疊、 是否能夠保持穩定性和免疫原性是關鍵所在。

最早制備的H5 重組亞單位疫苗是美國Protein Sciences 公司利用昆蟲細胞表達載有H5 基因的桿狀病毒系統制備了重組H5 疫苗（PanBlokR），采用的種子病毒是重組A/Hong Kong/97 病毒株。科研人員發現HA 主要以三聚體的形式存在，小部分裂解為HA1 與HA2 片段。該疫苗粒徑在30～40 nm之間，形成一種玫瑰花結構的寡聚物，目前已完成Ⅰ期與Ⅱ期臨床試驗［3，12］。免疫結果顯示，未加入佐劑時，免疫效果并不理想；以含有吡喃葡萄糖基脂（GLA）的穩定乳液（GLA-SE）作為佐劑時，明顯降低疫苗用量，提高志愿者的血清陽轉率等，達到美國FDA 的批準要求。

美國Fraunhofer 公司［13］通過煙草植物表達H5蛋白制備了重組亞單位疫苗。基于植物表達的生產方式快捷經濟，替代了以細胞培養為基礎的疫苗制備方式，所制備的亞單位疫苗安全性良好，在臨床前實驗中可以有效誘導小鼠和雪貂產生HI抗體和中和抗體。然而，臨床試驗表明，基于該亞單位疫苗免疫原性低于以細胞培養為基礎重組亞單位疫苗，說明H5 蛋白可能沒有正確折疊。VaxInnate 公司利用大腸埃希菌表達HA 的球狀頭部HA1 與鼠傷寒沙門氏菌的鞭毛2 型（STF2）的融合蛋白（VAX161）。鼠傷寒沙門氏菌的鞭毛素中含有Toll 樣受體5 的結合位點，可以提高HA 的免疫原性。臨床試驗結果發現志愿者經過2 針劑1.5-2.5 μg HA（低劑量）的疫苗免疫后，所產生的血清保護率為49%［14］。

4 病毒樣顆粒疫苗

流感病毒樣顆粒（virus-like particles，VLPs）疫苗是將流感病毒的抗原基因（如HA、NA、M1 或M2的基因）克隆到桿狀病毒系統內，經過細胞表達后自組裝制成。病毒樣顆粒可以模擬病毒的免疫原性，能夠有效誘導機體產生體液與細胞免疫［15］。并且病毒樣顆粒不含病毒基因組和相關抗原蛋白，不能在細胞內復制，不具有感染性，可重復給藥，適用人群廣泛。

VLPs 流感疫苗已被證明可以同時提高CD4+T 和CD8+T 細胞免疫反應，可以提供針對變異病毒的交叉保護力［16-17］。有研究對比了H5N1 VLPs疫苗與H5N1 重組HA 疫苗在小鼠體內的免疫效果。結果發現，VLPs 誘導更高水平的血凝抑制抗體，且提供小鼠針對異株H5N1 病毒的交叉保護力，在異株病毒攻毒試驗中沒有發生個體死亡現象［17］；而重組HA 亞單位疫苗組出現了一定程度的致病致死率。在與H5 全病毒滅活疫苗的對比中，VLPs 同樣顯示出優越的疫苗保護效果［18］。

美國Novavax 公司［19］將載有H5N1 病毒HA、NA 和M1 基因的桿狀病毒感染昆蟲細胞制備VLPs 流感疫苗。臨床試驗中選擇HA 含量分別為15 μg、45 μg 和90 μg 的疫苗制劑對18～40 歲健康人群進行2 針劑注射免疫，志愿者的血清陽轉率分別為40%、57%與61%，均能達到審批標準，而且該疫苗具有針對H5N1 土耳其株和安徽株流感病毒的交叉保護力。與重組亞單位疫苗相似，VLP 也可通過植物生長制備而成。加拿大Medicago 公司利用煙草植株表達基于流感病毒HA的病毒樣顆粒疫苗，以氫氧化鋁作為佐劑進行了臨床研究。結果發現疫苗所誘導的血清陽轉率分別為58%與57%，達到審批標準，但是血清保護率未達標。

5 DNA 疫苗

DNA 疫苗又稱核酸疫苗、基因疫苗，是繼巴斯德開創的減毒疫苗、 基因工程疫苗之后的第3代疫苗。DNA 疫苗實質是基因免疫，是指將含有編碼外源性蛋白基因的真核表達質粒DNA 直接接種到機體后，通過宿主細胞的轉錄翻譯系統合成抗原蛋白，誘導機體產生特異性細胞和體液免疫應答的一種新型的免疫策略。與傳統的滅活疫苗、減毒疫苗相比，DNA 疫苗的制備簡單迅速，穩定性高且儲存方便，無復制性，無感染性。目前，DNA 免疫已成為防治傳染病、腫瘤以及移植免疫治療的研究熱點。DNA 免疫與病毒自然感染誘導的免疫應答十分相似，能同時誘導細胞免疫和體液免疫。

基于HA、NA 基因的流感DNA 疫苗主要誘導體液免疫反應，基于NP 和M1 基因的DNA 疫苗傾向于誘導細胞免疫反應，并且可能提供交叉保護力。流感DNA 疫苗已經在小鼠、雪貂、靈長類動物以及一些臨床試驗中證實了有效性。

美國Vical 公司的研發人員［20］制備了基于H5的單價DNA 疫苗和基于H5、NP 和M2 的三價DNA 疫苗，以VaxfectinR為佐劑在18～45 歲健康人群中進行了臨床實驗。VaxfectinR是基于陽離子性脂質體的懸浮液，既可作為蛋白類疫苗的佐劑又可作為DNA 疫苗的佐劑。經過驗證，該疫苗制劑耐受性好，局部和系統性的不良反應與普通蛋白類疫苗相似。臨床試驗結果顯示單價DNA 疫苗的血清陽轉率為47%～67%，在誘導抗體反應方面優于三價DNA 疫苗且與蛋白類流感疫苗水平相當。另外，這2 種DNA 疫苗都可以誘導顯著的T細胞反應（75%～100%），并且可以提供針對H5N1病毒香港株和土耳其株的交叉保護力。這是首例證明基于H5 的DNA 疫苗可以誘導與滅活亞單位疫苗水平相當的臨床試驗，為開發人用H5N1流感疫苗的提供了新的策略。

美國國家衛生研究院［21］開展了臨床試驗研究基于H5 的DNA 疫苗聯合H5N1 單價滅活亞單位疫苗的免疫效果。研究發現DNA 疫苗的加入可以大大提高志愿者的抗體反應水平，并且DNA 疫苗與亞單位疫苗接種時間間隔越長，血清陽轉率越高（間隔4 周時，血清陽轉率僅為27%）。但是，在接種亞單位疫苗前接種2 次DNA 疫苗并不能顯著提高抗體反應水平。除此之外，DNA 疫苗的加入還大大提高了中和抗體的滴度，可以誘導機體產生范圍更廣的免疫保護力。分析其原因可能是，DNA 疫苗可以提高輔助性T 細胞的數量，促進CD4 細胞的分化，因而提高B 細胞的增殖。

6 重組活載體疫苗

經過基因改造后的一些病毒（腺病毒、痘病毒等）或細菌（沙門氏菌、大腸桿菌等）對宿主毒性較低，不具備傳染性，可以在宿主細胞內進行高水平的基因表達，并且不會插入宿主細胞基因組，是較為理想的外源性基因載體。有學者將H5N1 流感病毒的H5 基因插入具有復制缺陷的腺病毒載體中制備出H5N1 活載體疫苗，并且發現免疫1次即可誘導小鼠和雪貂體內產生有效的體液免疫和細胞免疫反應，并且顯示出針對異株流感病毒的交叉保護能力［22］。重組活載體疫苗可以誘導長效免疫反應，不需要佐劑，抗原用量少。

美國的疫苗生產商PaxVax 在18～40 歲的健康人群中進行了基于H5 的病毒活載體疫苗（PXVX0103）的Ⅰ期臨床試驗［23］。免疫劑量從107逐漸上升到1011個病毒顆粒，免疫程序為在1 d、6 d、114 d 對志愿者口服給予病毒活載體疫苗，口服給藥的3～12月后肌肉注射接種90 μg HA 的亞單位疫苗進行加強免疫。結果發現，活載體病毒疫苗在宿主之間不具備傳染性，安全性得到驗證。只口服活載體病毒疫苗可以誘導細胞免疫反應的發生，然而抗體反應很弱，志愿者血清轉染率僅為11%；而在志愿者接受107或108個病毒顆粒口服免疫后，再肌肉注射接種亞單位疫苗加強免疫，血清陽轉率大大提高，分別為69%和78%；當以1011活載體疫苗進行口服初免再肌肉注射接種亞單位疫苗時，志愿者血清陽轉率達到100%。H5N1 活載體病毒疫苗聯合亞單位疫苗的接種方式還誘導出顯著的細胞免疫反應，并產生了針對異株H5N1病毒的交叉保護力。PaxVax 公司計劃繼續開展PXVX0103 的Ⅱ期臨床試驗。

7 結論與展望

綜上所述，每種疫苗類型都有各自的優、缺點。滅活型裂解或亞單位疫苗安全性高，生產工藝成熟，適用人群范圍廣，有利于臨床報批，然而免疫原性較低，常需要加入佐劑增強其免疫效果，降低抗原用量。全病毒滅活疫苗同樣生產程序成熟，且所需抗原用量相對裂解疫苗較低，但是安全風險增大，且成本較高。減毒活疫苗免疫原性強，只需一次免疫即可達到免疫保護效果，不需要佐劑，然而其毒力回復的可能性限制了它的應用，只允許在某種流感病毒大流行時使用，且適用人群較窄，不適用于老人與兒童。

許多新型人用H5N1 禽流感病毒疫苗正在積極研發，研究人員開發了諸如基因工程疫苗、DNA疫苗等新型流感疫苗，以縮短生產周期，擴大生產量，降低疫苗的副反應并增強免疫保護效果，有些已經進入臨床研究階段。然而，出于對安全性的慎重考慮，這些新型疫苗被批準使用還需時日。另外，佐劑的研究會在很大程度上推進疫苗的發展。隨著疫苗生產技術以及工業基礎的發展，有理由相信在不久的將來會研究出免疫原性更高、 安全性更好的人用禽流感疫苗。