植物黃酮醇的檢測方法研究進展

方 芳,王鳳忠

(中國農業科學院農產品加工研究所,北京 100193)

黃酮醇作為一類重要的類黃酮化合物,在自然界中廣泛分布[1]。因其具有抗氧化[2]、抗炎[3]、抗菌[4]、抗癌[5]等多種生理功能,對肥胖[6]、心腦血管疾病[7]及老年癡呆[8]等多種老年及慢性疾病具有重要的治療和預防作用,而成為人類飲食中重要的功能活性因子。同時，因其對果蔬及食品的顏色[9]、口感及風味[10]的形成具有重要作用,而成為食品科學領域關注的重點。因此，對植物原料及食品中的黃酮醇進行定性定量分析對其相關產品的質量控制、安全性評價、藥效研究及新產品開發等均具有重要意義[11]。

黃酮醇雖具有重要的生理功能,但其多以結合態形式存在于植物及果蔬中,且極易在5-、3′-及4′-位點通過與葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、果膠糖、木糖及葡萄糖醛酸等糖分子結合形成穩定的糖苷類化合物[12]。由于黃酮醇糖苷類化合物種類繁多、結構復雜、異構體多樣、商業化標準品缺乏,且分離檢測方法存在局限等問題導致其分離提取及檢測分析十分困難[12-14]。因此了解植物黃酮醇分析檢測方法的研究進展,對于現有黃酮醇類化合物檢測方法的完善及新型檢測方法的開發具有重要意義。本文對現有植物黃酮醇的檢測方法進行了綜述,以期為黃酮醇在食品、保健品及醫藥領域的深入研究及應用提供理論依據及技術參考。

1 不同方法在植物黃酮醇提取中的應用

1.1 紫外分光光度計法(UV spectrophotometer)

紫外分光光度計法是通過測定物質在特定波長下的吸光度或發光強度來對目標物質進行定性定量分析的方法[15]。是根據吸收光譜對目標化合物的成分、結構及與其它物質間的相互作用進行研究的有效手段[16]。與其它檢測方法相比較,紫外分光光度計法具有操作簡單、儀器及檢測成本低、檢測時間短等特點[15,17],目前在醫藥領域黃酮類物質的檢測中應用較多。趙猛等通過與化學計量學手段結合,成功構建了一種可同時對紫花地丁中槲皮素和七葉內酯含量進行測定的紫外分光光度檢測法,該方法檢測快速、操作簡單、重現性好,可作為中草藥中槲皮素含量測定的備選方法[18]。Chaudhari等采用紫外分光光度計建立了一種可同時對囊泡制劑中的蘆丁和槲皮素進行檢測的方法,該方法簡單、快速、靈敏度高、準確性好,在257 nm和372 nm的檢測波長下可分別對蘆丁和槲皮素進行定量研究[19]。次年,Chaudhari等又利用紫外分光光度計建立了一種可同時對囊泡制劑中的槲皮素和鹽酸曲馬多進行檢測的方法,該方法除可簡單快速對樣品進行測定外,還具有靈敏度高、特異性強的特點,在372 nm處可對槲皮素有效檢測[20]。陳志剛等建立了一種可對原料藥中槲皮素含量進行快速測定的紫外分光光度檢測方法,該方法可在374 nm處對槲皮素含量進行有效測定,精密度高,線性良好,回收率可達100.88%,滿足方法學要求,是測定原料藥中槲皮素含量的可行方法[17]。由此可見,紫外分光光度計法作為植物類黃酮化合物檢測的傳統方法,具有操作簡單、檢測成本低、檢測時間短等優點,但由于檢測過程中目標化合物易受基質溶液、檢測體系中其它組分及吸收池的潔凈程度等因素的干擾[18],導致其在植物黃酮醇類化合物的檢測應用中受到限制,目前有關天然黃酮醇類化合物的檢測多應用于傳統中草藥或藥物制劑的檢測中,且可檢目標化合物的種類有限,而針對食品等復雜基質中的黃酮醇類化合物的檢測研究較少。在后續研究中,如何有效克服復雜基質及其它組分的干擾將成為未來紫外分光光度計法需要重點解決的問題。

1.2 高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)

高效液相色譜法是利用處于高壓環境中的待測化合物在固定相和流動相間具有連續交換的特性,借助待測化合物在兩相間的分配系數、親和力及吸附能力的差異對其進行分離的方法。其是在傳統液相色譜法的基礎上發展起來的新型檢測方法[21],同時也是對植物類黃酮化合物進行檢測的最精選的方法。與紫外分光光度計法相比,其具有檢測限低、靈敏度高、分析效率高、分析范圍廣等優點[21-22]。高效液相色譜作為一種高效的分離體系,要實現對目標化合物的定性定量分析,最終需要與多種檢測體系相結合,目前應用較多的包括紫外檢測、熒光檢測或二極管陣列檢測等檢測系統[12,23],而HPLC-UV和HPLC-DAD檢測法等也已成為從植物及食品原料中對黃酮醇等類黃酮化合物進行定性定量分析最為有效的方法之一[24-25]。Niu等通過反相高效液相色譜-二極管陣列檢測(RP-HPLC-DAD)建立了一種可對傳統中草藥返魂草(SeneciocannabifoliusLess)中9種黃酮醇類化合物同時進行分析檢測的方法。該方法采用C18柱為分離柱,乙腈水溶液為流動相,經梯度洗脫可對樣品中的黃酮醇類化合物進行有效分離及識別,9種黃酮醇的回收率均介于90.6%～102.5%之間,最低檢測限介于0.028～0.085 μg/mL之間。該方法靈敏度高、檢測效果良好,為中草藥黃酮醇類化合物的檢測提供了一種行之有效的方法[25]。買買提·吐爾遜等通過高效液相色譜-二極管陣列檢測(HPLC-PAD)構建了一種可對新疆不同品種巴旦杏中的槲皮素及山奈酚等黃酮醇類化合物進行定量研究的方法,該方法以甲醇-磷酸溶液(55∶45,V/V)為流動相,在360 nm檢測波長下可對樣品中的槲皮素及山奈酚進行良好分離,回收率高、線性范圍良好,可作為對巴旦杏進行質量控制和評價的理想檢測方法[26]。Benmeziane等采用HPLC-DAD法對3個不同鮮食紅葡萄品種的果皮黃酮醇進行測定,共檢測到4種黃酮醇糖苷類化合物,其中多以槲皮素糖苷類化合物為主[27]。Ma等構建了一種可對銀杏葉中黃酮醇類化合物進行快速檢測的HPLC檢測方法。該方法可在13 min內對銀杏葉提取物中的黃酮醇苷元(槲皮素、山奈酚和異鼠李素)及糖苷類化合物(蘆丁)進行同時檢測。通過對13種銀杏葉樣品,15種標準品提取物和10種銀杏葉產品進行分析,發現黃酮醇類化合物的種類和含量可作為判斷銀杏葉提取物及其相關產品是否摻假的重要依據,從而為銀杏葉產品的鑒偽提供了切實可行的方法[28]。由此可見,高效液相色譜法作為在傳統液相色譜法的基礎上發展起來的新型檢測方法,目前在多種植物源食品及中草藥黃酮醇類化合物的分析檢測中已得到應用,其所檢出的化合物包括黃酮醇苷元及黃酮醇糖苷等多種。與紫外分光光度計法相比,具有檢測范圍廣、檢測限低、靈敏度高等優勢,但因其檢測設備成本較高、單個樣品檢測時間較長、操作步驟復雜、對樣品前處理要求高、試劑消耗量大等缺點[22,29]導致其在植物黃酮醇類物質檢測中仍受到一定限制,而在復雜體系中無法對低含量化合物進行有效分離和定量等問題,也成為制約其在植物黃酮醇檢測中更加廣泛應用的重要原因。因此在現有分離檢測體系上開發更加高效和靈敏的分離和檢測技術及設備成為高效液相色譜法發展的必然趨勢。

1.3 液相色譜-質譜檢測法(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)

液相色譜-紫外檢測法或液相色譜-二極管陣列檢測法等因其具有成本相對較低、操作相對簡單等特點而在植物及食品類黃酮化合物的檢測中得到廣泛應用[13,30]。但由于自然界中黃酮醇糖苷類化合物種類繁多、結構復雜,單純采用高效液相色譜結合普通檢測器很難實現對于某些含量較低的黃酮醇糖苷類化合物的有效分離和準確定量[13]。液相色譜-質譜檢測法因其在獲得紫外光譜信息的同時,還可對目標化合物的相對分子質量和碎片離子進行檢測,對物質結構進行綜合解析,同時具有靈敏度高、抗干擾能力強等特點,目前已成為對自然界中黃酮醇類化合物進行定性定量檢測最為常用的方法之一[31-32]。Yaque等通過LC-UV-ESI-MS/MS對銀杏(GinkgobilobaL.)花中的黃酮醇類化合物進行識別,發現槲皮素糖苷類化合物是銀杏花的重要組分[33]。Wu等建立了可同時對綠茶、紅茶、烏龍茶中的黃酮醇等24種多酚類化合物進行檢測的HPLC-UV/ESI-MS檢測方法,該方法通過色譜保留時間和質譜信息同時對目標化合物進行識別,并對不同品種中的酚類構成進行區分,發現在目標化合物標準品缺失的情況下,質譜信息可作為識別目標化合物的有力補充,該方法可作為檢測綠茶、紅茶及烏龍茶中黃酮醇等酚類化合物的行之有效的方法[34]。Wu等通過高效液相色譜串聯飛行時間質譜(high performance liquid chromatography-time of flight mass spectrometer,HPLC-TOF-MS)對4個不同野茶樹(Camelliasinensis)品種中的15種黃酮醇糖苷類化合物進行識別,并通過超高效液相色譜串聯三重四極桿質譜(high performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometer,HPLC-QQQ-MS/MS)的多反應檢測模式(multiple reaction monitoring,MRM)對黃酮醇糖苷類化合物進行定量,檢測限和定量限的結果顯示該方法比HPLC檢測法靈敏性高、數據重現性好。黃酮醇在茶樹中多以單糖苷、雙糖苷及三糖苷等形式存在,且主要分布在嫩葉中,受試各茶樹品種中myricetin-3-O-galactoside的含量最高[13]。Souza等采用異亞丙基對黃酮醇葡糖苷和半乳糖苷異構體進行修飾,通過液相色譜串聯多級質譜(LC-MSn)手段對黃酮醇葡糖苷異構體和半乳糖苷異構體進行識別,發現該方法可有效解決黃酮醇糖苷異構體難以識別的問題,同時該方法為復雜基質中多糖的識別提供了可能[14]。由此可見,高效液相色譜-質譜檢測法因其可對物質的相對分子質量和碎片離子進行有效獲取,對物質結構進行綜合解析等特點而成為繼傳統高效液相色譜檢測法后發展起來的新興的檢測方法。在檢測某些復雜化合物及低含量化合物時可作為傳統高效液相色譜檢測法的有力補充。目前在植物黃酮醇及其糖苷類化合物的檢測中得到一定應用,在黃酮醇糖苷類化合物的識別上尤其發揮重要作用,通過對黃酮醇糖苷異構體進行適當修飾,甚至可用于黃酮醇糖苷異構體的識別領域。但該方法的缺點是檢測成本高,儀器普及性低,無法從復雜混合物中對目標化合物的異構體進行有效識別,因此目前其應用還十分有限[14,32]。而核磁共振雖可對化合物的分子結構進行有效識別,但對樣品的純度和含量要求較高,而樣品純化過程通常費時費力,因此自然界中黃酮醇類化合物的有效識別仍存在較大技術難題[14],高效液相色譜-質譜檢測法仍有很大改進和發展空間。

1.4 超高效液相色譜法(ultra performance liquid chromatography,UPLC)

超高效液相色譜法是在HPLC法基礎上發展起來的一種全新的檢測方法。與HPLC法相比,其具有快速、高效、分辨率高、靈敏度好等特點[12]。近年來其在檢測難度較高的黃酮醇苷元及糖苷類化合物的測定中也越發受到關注。Shim等構建了一種可同時對食品中楊梅酮、槲皮素、山奈酚及異鼠李素等黃酮醇苷元進行快速檢測的超高效液相色譜-光電二極管陣列檢測法(UPLC-PDA)。該方法采用反相C18柱為分離柱,對楊梅酮、槲皮素、山奈酚及異鼠李素等黃酮醇類化合物進行分離,各物質最低檢測限分別可達0.15、0.09、0.16和0.08 mg/kg,最低定量限分別為0.47、0.28、0.49和0.25 mg/kg。在保證各峰有效分離的情況下檢測時間僅需13 min,大大提高了食品中黃酮醇苷元類化合物的檢測速度、靈敏度及分辨率[12]。張維冰等建立了一種通過超高效液相色譜-光電二極管陣列檢測-串聯四極桿質譜(UPLC-PAD-MS/MS)對紅洋蔥中黃酮醇類化合物進行測定的方法,該方法不僅可對紅洋蔥中13種黃酮醇及其糖苷類化合物同時進行檢測,而且可對紅洋蔥不同部位的黃酮醇類化合物的分布和含量進行區分,為洋蔥中黃酮醇類化合物的測定提供了一種簡單快速、準確性好的檢測方法[35]。Kim和Shim建立了一種可對蕎麥、紅茶、野生歐芹中12種黃酮醇糖苷類化合物同時進行測定的檢測方法。該方法采用UPLC對黃酮醇糖苷進行分離,PDA對目標物質進行檢測,在350 nm檢測波長下,12種黃酮醇糖苷的回收率均較高,介于85.44%～108.79%之間,最低檢測限和最低定量限分別為0.32 mg/kg及0.97 mg/kg。方法準確性好、靈敏度高,為植物黃酮醇糖苷類化合物的檢測提供了新的選擇[32]。王智聰等通過超高效液相色譜-二極管陣列檢測-串聯質譜(UPLC-PD-MS/MS)聯用技術對茶葉中黃酮醇糖苷類化合物進行測定,在綠茶和紅茶中共識別到15種黃酮醇糖苷類化合物,其中包括6種槲皮素糖苷、3種楊梅酮糖苷及6種山奈酚糖苷類化合物。經串聯四極桿質譜對樣品中黃酮醇糖苷類化合物進行定量檢測發現,黃酮醇糖苷類化合物在綠茶和紅茶中的含量和分布存在顯著差異(p<0.05),其中綠茶中的黃酮醇糖苷類化合物總量約為紅茶的1.7倍。經驗證該方法簡單、快速、準確,可作為茶葉中黃酮醇糖苷類化合物分析檢測的可行方法[31]。Jiang等首次采用UPLC法對綠茶、烏龍茶及紅茶中的黃酮醇糖苷類化合物進行檢測,通過電噴霧串聯質譜共識別到18種黃酮醇糖苷類化合物,所檢測到的黃酮醇糖苷類化合物的總量為2.32～5.67 g/kg。在對不同茶種中的黃酮醇糖苷類化合物進行對比分析時發現,黃酮醇糖苷在綠茶、烏龍茶及紅茶中的總量無顯著差別,但不同茶種中的單體黃酮醇糖苷種類和含量不同,其中綠茶中以山奈酚糖苷為主,烏龍茶中以槲皮素和楊梅酮糖苷為主,而紅茶中則以槲皮素糖苷類化合物為主,證明該方法可作為區分不同茶種的重要依據[36]。由此可見,超高效液相色譜法因其采用更高的壓力和更短的色譜柱,使得其色譜峰的分散度變小,檢測速度、分辨率及敏感性顯著提高,較之傳統HPLC檢測法具有操作簡單、準確度高、檢測時間短、檢測效率和靈敏度高、對目標化合物的分離能力強等優點[12,31]。目前其在包括茶葉、洋蔥、銀杏等多種食品和植物的黃酮醇苷元及糖苷類化合物的檢測和定性定量研究中已得到一定應用,在食品摻假和植物品種或組織部位的識別和區分上可作為重要參考。

1.5 毛細管電泳法(capillary electrophoresis,CE)

毛細管電泳法是以毛細管為分離平臺,高壓直流電場為驅動力,根據目標化合物在特定環境中的淌度及分配行為不同對其進行分離的一種液相分離技術。其是現代微柱分離技術與傳統電泳技術完美結合的產物[37]。與傳統色譜檢測方法相比,毛細管電泳法具有柱效高、分辨率好、自動化程度高、適用范圍廣、分析時間短、前處理簡單、對試劑及樣品的消耗量小、經濟環保等優點[23,29,38]。作為HPLC法的重要替代方法目前已在植物及食品黃酮醇類化合物的分析中得到廣泛關注[23,29]。郭芳芳等通過高效毛細管電泳法對不同產區苦蕎中的黃酮醇類化合物進行檢測,發現在優化的電泳條件下,蘆丁、槲皮素、山奈酚等黃酮醇類化合物可以得到良好分離,在7 min的檢測時間內,各物質的最低檢測限分別可達1.80×10-5、1.24×10-5和2.51×10-5mg/mL,平均回收率介于95.5%～104.7%之間,證明該方法可作為檢測苦蕎中黃酮醇類化合物準確可靠的方法[39]。Gatea等建立了一種可在27 min內對蜂膠及植物提取物中20種多酚類化合物進行測定的毛細管電泳檢測方法,該方法可對蘆丁、槲皮素、山奈酚及高良姜素等黃酮醇類化合物進行良好分離,在優化的電泳條件下各化合物最低檢測限和定量限分別介于0.02～1.75 μg/mL和0.07～5.77 μg/mL之間[23]。Wang等采用毛細管電泳結合安培檢測法建立了一種可對傳統中草藥中8種類黃酮化合物進行分離檢測的方法,在分離電壓2000 V,緩沖液濃度18 mmol/L,溶液pH為10.2的條件下,可對蘆丁、槲皮素、槲皮甙、山奈酚及芹菜素等黃酮醇類化合物在33 min內實現良好分離,且檢測限均較低。采用該方法可對包括沙棘、貫葉連翹和側柏葉等傳統中草藥中的蘆丁、槲皮素、槲皮甙和山奈酚等化合物成功檢出,且各化合物的回收率均較高,分別介于84.7%～113%之間,證明該方法可用于傳統中草藥中黃酮醇類化合物的定性定量研究[40]。Memon等采用毛細管電泳結合光電二極管陣列檢測器(CE-PAD)建立了一種可對水果中類黃酮化合物進行快速分離的檢測方法。在緩沖液濃度為10 mmol/L,pH為8.5,檢測電壓為25 kV時,可對蘆丁及槲皮素等黃酮醇類化合物進行有效分離,方法穩定性高,重現性好,可作為水果及果汁中黃酮醇類化合物檢測的有效方法[38]。由此可見,毛細管電泳法目前已在多種植物及食品的黃酮醇類化合物檢測中得到探索性應用,所檢測的黃酮醇類化合物的種類日益增多。作為HPLC法的重要替代方法其在植物及食品中包括黃酮醇類化合物在內的多種生物活性物質的檢測中具有很好的應用前景[23,29]。但毛細管電泳法因其分離機理不同,具有包括毛細管區帶電泳(capillary zone electrophoresis,CZE)、膠束電動毛細管色譜(micellar electrophoresis capillary chromatography,MECC)、毛細管凝膠電泳(capillary gel electrophoresis,CGE)、毛細管等電聚焦(capillary isoelectric focusing,CIEF)、毛細管等速電泳(capillary isoelectric-phoresis,CITP)等多種分離模式和激光誘導熒光檢測(LIF)、紫外檢測(UV)、質譜檢測(MS)及安培檢測(AD)等多種檢測方法[37,40],目前在植物黃酮醇類化合物檢測上的應用模式還十分有限,在后續研究中還有待進一步拓寬。

1.6 電化學檢測法(electrochemical detection,ED)

雖然目前植物黃酮醇類化合物的檢測多以紫外分光光度計法、色譜法等進行,但分光光度計法的選擇性差,色譜法分析時間長、試劑消耗量大、檢測成本高[29],且對前處理的要求高,程序復雜、設備昂貴,從而給黃酮醇類化合物的檢測分析帶來諸多不便,因此近年來一些新興的電化學實驗手段也在逐漸涌現[41-42]。電化學檢測法是以研究對象的電響應為基礎發展起來的分析方法,其通過對電池參數變化的測定可獲得目標物質的含量及電化學性質[11]。由于黃酮醇類化合物具有明顯的電化學活性,因此電化學檢測法是較適合植物黃酮醇檢測的方法[43]。Wang等采用多壁碳結合1-十二烷基-3-甲基咪唑復合電極對蘆丁進行測定,發現該電極對蘆丁的氧化還原反應具有電催化作用,通過電荷轉移系數和標準速率常數可得蘆丁電化學參數,其最低檢測限可達0.01 μmol/L,由于該電極較之其它離子性液體電極具有更好的電化學性能,靈敏度高、穩定性好,可有效排除雜質干擾,為蘆丁的檢測提供了切實可行的方法[44]。Sun等采用基于結合石墨烯聚吡咯膜的分子印記聚合物對槲皮素進行電化學測定,采用差動脈沖伏安法對槲皮素的電化學行為進行分析,發現該方法具有良好的穩定性和重現性,可有效排除雜質化合物的干擾,槲皮素的檢測限可達4.8×10-8mol/L,證明該方法可用于復雜基質中槲皮素的檢測[43]。Arvand和Anvari采用石墨烯修飾的玻碳電極為反應電極,通過差動脈沖伏安法對蘋果和洋蔥中的槲皮素的電化學行為進行分析并對其進行定量測定,確定槲皮素的檢測限為3.6 nmol/L,證明該方法可用于食品中槲皮素的檢測[42]。王微采用分子印跡技術,分別以槲皮素、桑色素等黃酮醇類化合物為印記分子,利用電化學聚合的方法開發了一種黃酮醇分子印跡鄰苯二胺薄膜電化學傳感器,并對槲皮素及桑色素等黃酮醇類化合物的最佳測定條件進行優化,發現該方法靈敏度高、選擇性好,對銀杏葉類藥物中槲皮素含量測定的回收率可達99.2%～102%之間,可作為植物黃酮醇測定的可行方法[45]。由此可見,電化學檢測法作為一種快速、高效、靈敏度高、檢測限低的檢測方法[11],目前其在植物黃酮醇的檢測中已得到一定應用。有關電極種類、材料、測定方法及目標化合物的種類等方面的研究正日益深入。電化學測定法作為一種以電化學反應原理及目標物質的電化學性質為基礎的檢測方法,其較適用于具有電化學特性的黃酮醇類物質的檢測[11],在未來研究中還有很大的發展空間。

2 問題與展望

黃酮醇作為與人體健康密切相關的生物活性因子,其種類及含量的多少是衡量其相關產品質量優劣的重要依據,因此開發合適的定性定量分析檢測方法對其相關產品的質量控制、安全性評價、藥效分析及新產品開發等均具有重要意義。但黃酮醇類化合物種類繁多、結構復雜、異構體多樣、商業化標準品缺乏等問題給其分析檢測工作帶來極大障礙及困難,因此如何從植物原料中對黃酮醇類化合物進行有效檢測便顯得尤為重要。近年來紫外分光光度計法、高效液相色譜法、液相色譜-質譜檢測法、超高效液相色譜法、毛細管電泳法及電化學檢測法等多種分析檢測方法已在植物黃酮醇的測定過程中得到應用,但相關研究工作范圍較窄、所涉及的植物或食品種類及目標化合物種類均存在較大局限,且現有檢測方法的構建缺乏系統性和延續性。

針對上述問題,未來在植物黃酮醇檢測方法的研究中,應注意將目標化合物自身的性質和現有檢測方法的特點有機結合,充分發揮不同檢測方法的優勢,彌補其不足,加強分析檢測工作的系統性和連貫性。在應用紫外分光光度計法時應注意開發可有效縮減或排除基質及檢測體系中其它組份干擾的方法。在應用色譜檢測法時應注意開發可有效縮短檢測時間、減少試劑用量、降低檢測成本的方法。在應用毛細管電泳檢測法時注意加強對新型檢測模式的探索。在電化學檢測法的應用過程中注意加強新型檢測電極及材料的開發等。

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