樹鼩腺病毒TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法的建立及初步應用

宋慶凱，李曉飛，苗雨潤，張志成，王 璇，袁 圓，代解杰，孫曉梅

(中國醫學科學院/北京協和醫學院醫學生物學研究所樹鼩種質資源中心，云南省重大傳染病疫苗研發重點實驗室，中國醫學科學院醫學生物學研究所實驗樹鼩標準化與應用研究省創新團隊，昆明 650118)

樹鼩(Tupaiabelangeri)作為與靈長類動物親緣關系最近的新型模式動物，在人類疾病模型尤其是感染性疾病模型研究中發揮著不可或缺的作用，已逐步成為生物醫學研究的熱點[1]。前期開展的相關研究表明，野生來源樹鼩中腺病毒攜帶率較高，并有疑似病例發生，被列為樹鼩實驗動物微生物質量控制的檢測指標之一。因此，建立一種高效、快速，可反應個體病毒載量的實時熒光定量PCR方法勢在必行。

樹鼩腺病毒(tree shrew adenovirus，TAV)屬于腺病毒科，哺乳動物腺病毒屬。迄今，已發現有100多種腺病毒能感染人、哺乳動物和禽類。腺病毒感染會引起急性上呼吸道感染、急性眼結膜炎、急性出血性膀胱炎、腹瀉等疾病[2]。目前，在樹鼩腺病毒(TAV)檢測方面，已有普通PCR方法報道[3]，但此類方法只可用于TAV定性檢測且靈敏度低。本研究根據TAV的3’保守區域設計特異性引物，通用性好，穩定性高，適用于不同型別病毒株檢測，建立了操作簡便、敏感性高、特異性強、重復性好、可實時定量分析TAV感染程度的TaqMan實時熒光定量PCR方法[4-8]，以期為TAV的分子流行病學調查和早期感染研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

野生來源成年樹鼩，性別不限，在普通級環境設施中僅飼養了3個月，體重120～150 g。飼養環境：溫度18℃～28℃，相對濕度30%～60%，噪音≤ 60 dB，光照強度100～150 lx。實驗動物來源于醫學生物學研究所樹鼩種質資源中心[SCXK (滇) K2013-0001]，實驗操作在醫學生物學研究所樹鼩種質資源中心實驗設施進行[SYXK (滇) K2013-0001]。

1.2 主要試劑與儀器

Viral DNA Kit(購自Omega)，iTaqTMUniversal Probes One-Step Kit(購自Bio-Rad)。CFX96TM熒光定量PCR儀(Bio-Rad)，核酸蛋白檢測儀，Vortex QL-902，制冷機(雪科)，臺式微量高速離心機，恒溫水浴鍋，離心管。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣本來源及DNA提取

樹鼩腺病毒、樹鼩呼腸孤病毒、EV71、人單純皰疹病毒1型來自本實驗室保存。使用Viral DNA Kit提取病毒DNA。詳細操作根據產品說明書進行。

1.3.2 TaqMan實時熒光定量PCR的建立

(1)引物設計合成：從NCBI中檢索獲得TAV的全基因組，利用DNA Star軟件設計擴增病毒株3’保守區域(22 989 bp～23 476 bp)特異性引物，引物序列為：TAVF：5’-AAAGAATGCCCACCTCCCAT-3’和TAVR：5’-CAGTGGCAGGCCATTAAGC-3’，擴增的目的片段為122 bp。根據測序所得目的基因序列設計熒光探針引物：5’-Fam-CTCGCCGCCGC CGGTTTCAC-Tamra-3’。委托昆明碩擎生物科技有限公司合成。

(2)陽性標準品的構建：以本實驗室保存的陽性TAV DNA作為模板，進行目的基因片段擴增。反應體系：金牌Mix(green)20 μL，10 μM TAVF 1 μL，10 μM TAVR 1 μL，DNA模板3 μL，終體積25 μL。試劑盒參考退火溫度為55℃～60℃，優化后的反應條件：98℃ 2 min；98℃ 10 s，58℃ 15 s，72℃ 15 s，共35個循環；72℃ 5 min。擴增產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定；膠回收純化；將目的基因片段與PUC57載體進行連接；連接后產物轉化DH5α感受態細胞；測序驗證。采用紫外分光光度計測定A260/280數值，計算質粒濃度，將其換算為質粒拷貝數[每微升拷貝數=質粒濃度×(6.02×1023)×(A260/280×10-9)/(DNA堿基數×660)]，式中，A260/280單位為ng/μL。

(3)繪制標準曲線：將(2)中的質粒標準品10倍倍比稀釋至每微升101拷貝。用梯度稀釋的標準品作為模板，進行擴增。以每微升108～101拷貝共8個梯度標準品建立標準曲線，設置復孔及陰性對照。擴增體系(20 μL)：2×iTaqTMUniversal Probes One-Step Reaction Mix 10 μL，10 μM TAVF 1 μL，10 μM TAVR 1 μL，10 μM探針引物2 μL，標準DNA模板3 μL，Easy Dilution 3 μL。優化后的擴增條件為：95℃ 2 min，95℃ 10 s，58℃ 30 s，共40個循環。通過軟件自動繪制出標準曲線。

(4)靈敏性檢測：以(3)中梯度稀釋的質粒標準品為模板，進行TaqMan實時熒光定量PCR擴增反應，檢測試驗的靈敏性。

(5)重復性及特異性檢測：用梯度稀釋的質粒標準品作為模板，每個標準品做3個平行管，通過計算Ct均值、變異系數(即相對標準差：指標準差除以平均值，以百分數表示)分析試驗的重復性。以樹鼩呼腸孤病毒、EV71、人單純皰疹病毒1型、TAV作為樣品，測定TaqMan實時熒光定量PCR特異性。

1.3.3 TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法的初步應用

采取48份人工飼養3個月野生來源樹鼩糞便，并用Viral DNA Kit提取DNA作為模板，進行熒光定量PCR檢測。

2 結果

2.1 目的片段的鑒定

重組質粒用PvuII酶切，結果見圖1A，酶切后獲得兩個片段，長度相加即為質粒及插入片段大小。對重組質粒標準品進行PCR鑒定，擴增獲得一條約122 bp的特異片段，結果見圖1B，與預期擴增結果相符。對目的基因片段進行測序分析，NCBI比對結果同TAV 3’保守區域(22 989 bp～23 476 bp)序列完全一致，表明目的基因片段已成功接入載體中。

注：從左到右標準品拷貝數依次為：每微升3.7×101，3.7×102，3.7×103，3.7×104，3.7×105，3.7×106，3.7×107，3.7×108拷貝。圖中“○”代表標準品。圖2 不同稀釋度陽性質粒擴增形成的標準曲線Note. The number of copies of the standard from left to right is: 3.7×101, 3.7×102, 3.7×103, 3.7×104, 3.7×105, 3.7×106, 3.7×107, 3.7×108 copies per microliter, respectively. “○”represents standard values.Fig.2 Standard curve of plasmid DNA in different dilutions

注：A：M：1 kb DNA marker，1：酶切后的PUC57重組質粒；B：M：500 bp DNA marker，1：重組質粒PCR產物。圖1 目的片段的擴增Note. A: M: 1 kb DNA marker; 1: PUC57 recombinant plasmid after digestion. B: M: 500 bp DNA marker; 1: PCR product of recombinant plasmid.Fig.1 Amplification of target fragment

2.2 TaqMan實時熒光定量PCR標準曲線

重組質粒標準品經核酸分析儀檢測結果：A260/280值為1.93，濃度為50 ng/μL，即拷貝數為每微升3.7×109拷貝。以10倍梯度稀釋的重組質粒標準品為模板進行擴增，繪制標準曲線(圖2)，相關系數R2為0.998，擴增效率為95.7%，以起始模板量的對數值為X軸，循環數(Ct值)為Y軸做回歸曲線，即標準曲線(Y=-3.430lgX+ 37.951)，具有良好的線性關系。

2.3 TaqMan實時熒光定量PCR靈敏性

靈敏性檢測試驗擴增結果如圖3，1～8為不同稀釋濃度的陽性質粒，當陽性質粒拷貝數為每微升3.7拷貝，才出現特異性擴增曲線且陰性對照無特異性擴增，表明該方法的最低檢測靈敏度可達每微升3.7拷貝。

2.4 TaqMan實時熒光定量PCR重復性

分別以每微升3.7×105、3.7×106和3.7×107拷貝的重組質粒標準品為模板進行擴增，每份標準品設置3個平行管，通過計算Ct值的變異系數對試驗重復性進行評價，結果詳見表1，變異系數不足0.5%。

2.5 TaqMan實時熒光定量PCR特異性

特異性試驗檢測結果(圖4)顯示，在40個反應循環內，以每微升3.7×106拷貝的質粒標準品和TAV為模板的PCR反應有特異性擴增曲線。以樹鼩呼腸孤病毒、EV71、人單純皰疹病毒1型為模板的PCR反應均無擴增曲線。表明建立的基于TaqMan探針實時熒光定量PCR方法具有高度特異性。

注：1～8：每微升3.7×107，3.7×106，3.7×105，3.7×104，3.7×103，3.7×102，3.7×101，3.7×100拷貝；9：陰性對照。圖3 TaqMan實時熒光定量PCR靈敏性檢測結果Note. 1-8: 3.7×107, 3.7×106, 3.7×105, 3.7×104, 3.7×103, 3.7×102, 3.7×101, 3.7×100 copies per μL, respectively; 9: Negative control.Fig.3 Sensitivity of the TaqMan real-time fluorescence quantitative PCR

每微升拷貝數CopiespermicroliterCt值 Ctvalue123 平均Ct值AverageofCtvalue變異系數(%)Coefficientofvariation37×107131813191321131901137×106165316571659165601837×1052001200920112007026

注：圖中“其他病毒”指樹鼩呼腸孤病毒、EV71、人單純皰疹病毒1型。圖4 TaqMan實時熒光定量PCR特異性檢測結果Note. “Other viruses” in the figure are tree shrew reovirus, EV71, human herpes simplex virus type 1.Fig.4 Specific test results of the TaqMan real-time fluorescence quantitative PCR

2.6 TaqMan實時熒光定量PCR初步應用

如圖5所示，在反應的35個循環內，48份樣品中有19份陽性，陽性率為39.58%，最低檢出濃度為每微升3.92拷貝。傳統方法檢測陽性率僅為25%(12/48)。因此，建立的TaqMan實時熒光定量PCR方法更加靈敏且高效，可更好地運用于樹鼩腺病毒的檢測，為其防控提供更精準的檢測方法。

圖5 初步應用檢測結果Fig.5 Preliminary application of the TaqMan real-time fluorescence quantitative PCR

3 討論

樹鼩腺病毒是無囊膜線性單分子雙股DNA病毒，歸類于腺病毒科哺乳動物腺病毒屬。在前期飼養觀察中，發現該病毒可普遍感染樹鼩并引起急性上呼吸道感染、急性眼結膜炎、急性出血性膀胱炎、腹瀉等多種疾病。Darai等早在1980年報道，在38份樹鼩腎組織培養物中分離獲得1株TAV[9-10]，病毒可凝集大鼠及人“O”型紅細胞。陳元鼎等[11]1987年報道，在90份成年云南源樹鼩大便中檢測到12份腺病毒陽性，陽性率為3%。吳小閑等[12]1990年報道，從云南野生樹鼩咽拭子、腎細胞培養物和糞便中分離到10株TAV，并鑒定為2個血清型(TAV-1和TAV-2)。王淑菁等[3]建立了樹鼩腺病毒PCR檢測方法，檢測了56份剛從野外捕獲來源的樹鼩糞便DNA，有24份陽性，檢出的陽性率達到42.85%，結果顯示野生樹鼩具有較高的攜帶率。

迄今，在腺病毒檢測方面已有多種方法。其中，間接免疫熒光檢測方法適用于細胞培養物中TAV的檢測；ELISA檢測方法主要適用于對TAV抗體的篩查，其缺點是檢測結果假陽性偏高；PCR檢測法具有快速方便、靈敏性好、特異性強等特點，其中實時熒光定量PCR[13-14]方法與傳統PCR方法比較又具有更大的優勢，最大的優勢是可實時檢測反應早期到終點過程中PCR的擴增情況，此外還具有靈敏性好、所需樣品少、特異性強、可精確進行定量分析等特點，被認為是病原學檢測的金標準。

本研究根據TAV的3’保守區域設計特異性擴增引物[15-17]，采用傳統PCR方法擴增目的片段并膠回收純化連接載體，構建出重組質粒標準品，并探索優化反應條件及擴增體系，成功建立了高效、特異、靈敏性強的TAV TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法。重復性檢測試驗中以3個梯度標準品進行3次重復，變異系數檢測結果均小于0.05%，即試驗重復性好。采用此方法檢測樹鼩源呼腸孤病毒以及其他引起腹瀉、急性眼結膜炎等疾病的病毒均無交叉反應，表明建立的檢測方法具有良好的特異性。研究中應用此方法檢測人工飼養3個月的野生來源樹鼩TAV攜帶情況，檢測結果顯示，此方法可定性及定量分析不同個體病毒載量情況，靈敏度高，在35個循環內最低檢測限度達每微升3.92拷貝。陽性檢出率為39.58%，略低于王淑菁等[3]報道的野生源樹鼩病毒檢測結果，原因可能與樣品來源有關。

本研究建立的基于TAV的TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法具有高效、靈敏度高、特異性和重復性好的優點，既可定性分析又可定量分析[18]。該檢測方法的構建為TAV的致病[19]、溶瘤[20]機理研究提供了詳細可靠的技術支持，同時也對TAV防控具有重要作用。

[1] 向征, 楊照青. 樹鼩寄生蟲研究進展 [J]. 中國人獸共患病學報, 2014, 30(9): 955-959.

[2] 殷震, 劉景華. 動物病毒學 [M]. 北京: 科學出版社, 1997: 1104-1129.

[3] 王淑菁, 付瑞, 李曉波, 等. 樹鼩腺病毒(TAV)PCR方法的建立及初步應用 [J]. 中國比較醫學雜志, 2014, 24(12): 42-46.

[4] Jothikumar N, Cromeans TL, Hill VR, et al. Quantitative real-time PCR assays for detection of human adenoviruses and identification of serotypes 40 and 41 [J]. Appl Environ Microbiol, 2005, 71(6): 3131-3136.

[5] 萬春和, 陳翠騰, 傅秋玲, 等. 禽坦布蘇病毒TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法的建立 [J]. 西北農林科技大學學報(自然科學版), 2016, 44(8): 49-54.

[6] 邱麗葉. 禽腺病毒熒光定量PCR檢測方法的建立與初步應用 [D]. 東北農業大學, 2016.

[7] 曹偉偉, 郭抗抗, 許信剛, 等. 豬圓環病毒II型TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法的建立與應用 [J]. 西北農林科技大學學報(自然科學版), 2013, 41(1): 13-18.

[8] 熊建英. 熒光定量PCR快速檢測登革1型病毒 [D]. 南方醫科大學, 2012.

[9] Darai G, Matz B, Flügel RM, et al. An adenovirus fromTupaia(tree shrew): growth of the virus, characterization of viral DNA, and transforming ability [J]. Virology, 1980, 104(1): 122-138.

[10] Sch?ndorf E, Bahr U, Handermann M, et al. Characterization of the complete genome of theTupaia(tree shrew) adenovirus [J]. J Virol, 2003, 77(7): 4345-4356.

[11] 陳元鼎, 戴國珍, 李軍, 等. 樹鼩大便中腺病毒的實驗研究 [J]. 中國人獸共患病學報, 1987, 3(3): 2-4.

[12] 吳小閑, 唐恩華, 張新生, 等. 樹鼩腺病毒(I和II型)的生物學性狀、抗原關系和血清抗體的研究 [J]. 中國醫學科學院學報, 1990, 12(2): 153-156, 15.

[13] 宋爽, 趙柏林, 曲萍, 等. 牛病毒性腹瀉病毒、牛傳染性支氣管炎病毒和口蹄疫病毒多重TaqMan熒光定量PCR檢測方法的建立 [J]. 中國預防獸醫學報, 2017, 39(2): 133-136.

[14] Tam S, Clavijo A, Engelhard EK, et al. Fluorescence-based multiplex real-time RT-PCR arrays for the detection and serotype determination of foot-and-mouth disease virus [J]. J Virol Methods, 2009, 161(2): 183-191.

[15] 李曉飛, 殷安國, 張媛, 等. 樹鼩呼腸孤病毒RT-nPCR檢測方法的建立及初步應用 [J]. 中國比較醫學雜志, 2014, 24(6): 63-68.

[16] 王楷宬, 邱源, 紀海旺, 等. 通用引物擴增甲型流感病毒基因組及其高通量測序 [J]. 中國動物檢疫, 2017, 34(1): 90-93.

[17] 任少堂, 秦一中, 汪偉業, 等. 用高度保守區引物和套式PCR擴增丙型肝炎病毒 [J]. 第二軍醫大學學報, 1993, 14(5): 424-427.

[18] 胡丹, 郝麗娜, 李丙軍, 等. 漢坦病毒實時熒光定量PCR檢測方法的建立 [J]. 中國病原生物學雜志, 2014, 27(4): 347-350.

[19] 劉娟. 人呼吸道腺病毒55型的基因組學與病原學特征研究 [D]. 中國人民解放軍軍事醫學科學院, 2014.

[20] Kirn D. Replication-selective oncolytic adenoviruses: virotherapy aimed at genetic targets in cancer [J]. Oncogene, 2000, 19(56): 6660-6669.