B超引導下獼猴肝臟及腎臟組織的活體穿刺方法

李哲麗，葉尤松，張 庶，馮 蕾，王陳蕓，陳 倩，唐東紅*

(1.中國醫學科學院/北京協和醫學院醫學生物學研究所，昆明 650118； 2.昆明醫科大學第二附屬醫院，昆明 650101； 3.云南省中醫學院，昆明 650200)

獼猴(Macacamulatta)，又名恒河猴(rhesus monkey)，在形態學、生理生化代謝等方面與人類非常相似，是較為理想的實驗動物，常用于許多重要的科學研究。肝是脊椎動物最大的實質性器官，有代謝、貯存糖原、分泌膽汁及吞噬防御等重要功能。在正常獼猴體內肝位于右上腹，上界在右鎖骨中線第五肋骨上緣，下界與右季肋緣平齊，一般不超出右側肋弓。肝臟血液供應豐富，呈紅褐色，可分為左、右、前、后四個緣和兩個面(膈面和臟面)。腎是脊椎動物的重要器官，屬于泌尿系統的一部分，負責過濾血液中的雜質、維持體液和電解質的平衡，最后產生尿液經由后續管道排出體外；同時也具備內分泌的功能以調節血壓等，在維持機體酸堿平衡、機體的代謝、廢物排泄等方面起著重要作用。在獼猴體內，正常獼猴具備兩枚腎，位于腰部兩側后方，腎為暗紅色實質性器官，表面光滑，可分為上、下兩端，前、后兩面，內、外側兩緣。成年雄性獼猴腎重量約16～32 g，雌性獼猴腎重量約15～33 g，雌雄獼猴腎重量差異不大。左腎較右腎稍大，腎縱軸上端向內、下端向外，因此兩腎上極相距較近，下極較遠，腎縱軸與脊柱所成角度為30°左右。

肝和腎是獼猴的重要器官，隨著醫學研究的發展，在人類疾病動物模型的建立及相關機理研究實驗中，常需要觀察其疾病狀態下基因在轉錄水平及蛋白表達水平方面的變化，獲得相關實驗數據[1-2]。常規方法取材是直接處死動物來獲取相應的組織，采用活體取材的方式獲得肝、腎組織以提取RNA及蛋白樣品[3]，可以實時獲得藥物代謝不同階段的組織樣品，進行相關分析，符合實驗動物福利制度，降低實驗成本[4-5]。

近年來，超聲技術被應用于人類肝、腎活體穿刺術，具有定位準確、成功率高、并發癥少等特點，彌補了傳統手術定位不準、成功率低等不足[6]。B超引導的活體穿刺方法應用于獼猴獲取新鮮組織樣品少有報道，現通過B超引導對獼猴肝、腎進行活體穿刺取材，建立一套簡單、快捷的獲取肝、腎組織取材方法，為獼猴肝、腎代謝研究奠定基礎動物實驗技術。在實施穿刺術時，需要使用B超探查獼猴的肝、腎并進行定位，再通過穿刺引導架引導穿刺針進行穿刺取材，定位的準確與否是成功的關鍵[7]。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

普通級成年獼猴4只，體重8～12 kg，雄性，來源于中國醫學科學院醫學生物學研究所[SCXK (滇) K2014-0001]，實驗在中國醫學科學院醫學生物學研究所完成[SYXK (滇) K2014-0007]。動物實驗由中國醫學科學院醫學生物學研究所動物實驗倫理審查委員會通過，批準號為2017-004。同時按照實驗動物的3R原則給予人道主義關懷。

1.2 主要試劑與儀器

鹽酸氯胺酮麻醉劑，每支2 mL(0.3 g)，購于江蘇中牧倍康藥業有限公司；醫用碘伏，購于德州默霖消毒科技有限公司；TriPure，購于Roche公司；瓊脂糖，購于碩陽科技有限公司。彩色電腦聲像儀(MyLab 30CV，意大利百勝)；巴德活檢槍(MG15-22，上海庫豐實業有限公司)；活檢穿刺針(100 mm，河南省圣吉安醫療器械有限公司)；穿刺引導架(ABS421，上海卉力生物科技有限公司)；B超介入手術包，購于昆明寶利康醫療衛生用品有限公司；沙袋、布腹帶(自制)；剃毛器(寶潤P6大功率寵物電推剪)；高速冷凍離心機(Sigma公司)；ND-1000紫外分光光度計(美國NanoDrop公司)；電泳儀(美國Bio-Rad公司)；凝膠成像分析系統(美國Bio-Rad公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物的準備

根據動物體重進行肌肉注射鹽酸氯胺酮對動物進行麻醉，麻醉劑量為5～10 mg/kg，注射后約5～10 min，待其麻醉后，用剃毛器剃去其右上腹肋間至側腰部肋緣下區域的被毛，以便于B超探頭的探查。將手術墊巾鋪在動物手術臺上，將已剃好被毛的獼猴置左側臥位擺放在手術臺上，用碘伏進行消毒，并加蓋無菌手術洞巾待手術。

1.3.2 B超的準備及穿刺針的安裝

從B超介入手術包取出一次性塑料探頭套子將3.5 Hz彩色電腦聲像儀(MyLab 30CV)探頭套上，以避免探頭被交叉污染。將ABS421 B超穿刺引導架安裝在B超探頭上，見圖1，將穿刺針安裝在活檢槍上待用。

注：A：穿刺引導架。圖1 安裝完成穿刺引導架的3.5 Hz的B超探頭Note. A: Puncture guiding frame.Fig.1 A 3.5 Hz transducer fixed with a guiding frame

1.3.3 肝穿刺取材

將3.5 Hz的B超探頭于獼猴右上腹肋間區域進行探查，取腋前線的第八肋間以及腋中線的第九肋間作為穿刺點[8]的參考位置，穿刺點的主要依據是在B操引導下，通過B超的定位尤其在穿刺引導架的引導下進行，穿刺者立于獼猴左側，配合影像操作人員操作[9]，當B超探查到穿刺目標并鎖定時，根據B超實時圖像，注意避讓膽囊，將活檢槍的射程調為15 mm，將穿刺針在穿刺引導架的引導下垂直經皮膚插入腹部約1 cm，經腹穿刺進針點見圖4中的“1”(箭頭所示)，觀察動物的呼吸，輕微移動B超探頭，觀察B超實時影像，使穿刺目標與穿刺針位置在引導線內，即穿刺目標與穿刺針為垂直部位，并避開膽囊，按動穿刺針扳機按鈕進行穿刺，如圖2A中“4”顯示的白色回聲影像為肝臟穿刺針瞬間到達回聲，圖2B中“3”為猴體內的膽囊，“2”代表整個肝臟回聲區域。穿刺后迅速拔出穿刺針。

注：A：進入肝臟的穿刺針超聲回聲圖；B：肝臟超聲回聲圖；C：B超引導下肝臟穿刺示意圖。1：穿刺引導線；2：整個肝臟回聲區域；3：膽囊；4：穿刺針。圖2 肝臟穿刺B超影像及示意圖Note. A: Ultrasonic image of the puncture needle into the liver. B: Ultrasonic image of the liver. C: Schematic sketch. 1: Puncture guide line; 2: Whole liver echo area; 3: Gallbladder; 4: Puncture needle.Fig.2 Images and schematic diagram of B-mode ultrasonography of liver puncture

1.3.4 腎穿刺取材

將3.5 Hz的B超探頭于獼猴側腰部肋緣下腹部區域進行探查，當B超探頭探到穿刺目標腎時，進一步調整探頭的方向以便于確認所要穿刺的腎器官，穿刺目標為右腎下脊實質，穿刺的時候根據B超實時圖像，注意避讓腎下腔靜脈及門靜脈，將活檢槍的射程調為15 mm，將穿刺針在穿刺引導架的引導下垂直經皮膚插入腹部約1 cm，經腹穿刺進針點見圖4中的“2”(箭頭所示)，觀察動物的呼吸，輕微移動B超探頭，觀察B超實時影像，使穿刺目標與穿刺針位置在引導線內，即穿刺目標與穿刺針為垂直部位，并避開腎血管，按動穿刺針扳機按鈕進行穿刺，如圖3A中“5”顯示的白色回聲影像為腎穿刺針瞬間到達回聲，圖3B中“3”、“4”分別為猴體內靠近腎臟的兩大血管，腎腔靜脈和門靜脈，“2”代表整個腎臟回聲區域。穿刺時間為1/1000 s，腎穿刺深度在12～15 mm之間[2]，穿刺后迅速拔出穿刺針。

注：A：進入腎臟的穿刺針超聲回聲圖；B：腎臟超聲回聲圖；C：B超引導下腎臟穿刺示意圖。1：穿刺引導線；2：整個腎臟回聲區域；3：腎腔靜脈；4：門靜脈；5：穿刺針。圖3 腎穿刺B超影像及示意圖Note. A: Ultrasonic image of the puncture needle into the kidney. B: Ultrasonic image of the kidney. C: Schematic sketch. 1: Puncture guide line; 2: Whole kidney echo area; 3: Vena cava of kidney; 4: Portal vein; 5: Puncture needle.Fig.3 Images and schematic diagram of B-mode ultrasonography of kidney puncture

注：1：肝穿刺點；2：腎穿刺點。圖4 肝、腎穿刺傷口Note. 1: Puncture site of the liver; 2: Puncture site of the kidney.Fig.4 Puncture sites of the liver and kidney

1.3.5 樣品的處理

穿刺后將穿刺針迅速拔出后，肝、腎組織樣品已采集到針頭的凹槽中，凹槽內腔每槍可獲得組織樣品約10～14 mg。經測量計算，穿刺針的凹槽內腔體積為13.35 mm3，經肝、腎的質量及體積初步計算得獼猴肝的密度ρ肝=1.0029 mg/mm3，腎的密度ρ腎=0.9923 mg/mm3，故若取樣剛好填滿穿刺針凹槽內腔，則穿刺取到的樣品質量分別為m肝=13.39 mg，m腎=13.25 mg，因取樣誤差，所取到的樣品質量約為10 mg(所取到的樣品未填滿穿刺針凹槽內腔)～ 14 mg(穿刺非常成功，樣品塞滿甚至溢出穿刺針凹槽內腔)。將所獲得的肝、腎組織置入分裝好1 mL TriPure試劑的離心管中，加蓋顛倒使組織浸泡在TriPure液體中，標記好樣品編號待用。

1.3.6 穿刺術后動物的護理

在穿刺完成后，須再用B超探頭掃查腹腔，觀察有無腹腔積液，排除大出血情況。為動物的穿刺部位蓋上無菌紗布并將小沙袋壓在紗布之上，并用布腹帶把穿刺部位扎好即可，見圖5。為防止動物蘇醒后動物大幅度動作引起穿刺部位出血，在動物即將蘇醒時根據其狀態再次注射相應劑量麻醉劑，可適當延長動物安靜休息時間。術后禁食3 h，穿刺術后護理應連續觀察動物6 h以上，以防出現需緊急處理的異常情況，次日清晨后可進食[10]。

圖5 自制裹腹帶包扎穿刺部位Fig.5 The self-made abdominal belt

1.3.7 獼猴肝、腎組織總RNA的提取

將裝有新鮮腎組織(10～14 mg)的離心管，放入組織研磨儀(50 Hz，45 s)，充分研磨，靜置5 min，直至管內為澄清液體，將液體轉移至1.5 mL的離心管內，再靜置5 min，加入200 μL氯仿，并漩渦振蕩，充分靜置15 min，再以11 441 r/min于4℃離心25 min，吸取上清液450 μL于另一離心管，加入等體積異丙醇，充分混勻，靜置10 min，以11 441 r/min于4℃離心10 min，棄上清液，待管內壁稍干，加入1 mL -20℃預冷的75%乙醇洗滌沉淀，9045 r/min于4℃離心5 min，棄上清液，待內壁充分干燥，加入30 μL DEPC水(無RNA酶水)溶解沉淀。

1.3.8 RNA濃度測定及完整性檢測

(1)所提取的RNA濃度測定：取RNA提取液2 μL于ND-1000紫外分光光度計測定RNA濃度。

(2)所提取的RNA完整性檢測：取RNA提取液2 μL于1.5%瓊脂糖凝膠以90 V、400 mA的條件進行電泳20 min，并于凝膠成像分析系統下觀察28s、18s和5s RNA條帶，分析RNA的完整性。

2 結果

2.1 穿刺術后觀察及動物恢復狀況、成活率

在穿刺完成后，用B超探頭掃查腹腔，未見腹腔積液，排除大出血情況，經后續觀察，動物的呼吸正常、恢復情況良好，動物無一例死亡，成活率100%。

2.2 RNA濃度測定

對所提取的總RNA經ND-1000紫外分光光度計測定RNA濃度，數據如下：其中A260 nm/A280 nm介于1.8～2.0之間，說明所獲得的RNA純度高。見表1。

2.3 RNA檢測結果

圖6可見5s、18s、28s RNA條帶明亮，證明提取得到RNA無降解，可用于后續實驗。

表1 所獲得的RNA濃度及A260 nm/A280 nm、A260 nm/A230 nm比值Tab.1 Concentration and A260 nm/A280 nm, A260 nm/A230 nm ratios of the extracted total RNA by ultraviolet spectrophotometry

注：1～4:4只動物腎組織；5～8:4只動物肝臟組織。圖6 RNA電泳凝膠成像圖Note. 1-4: Kidney tissues of 4 animals. 5-8: Liver tissues of 4 animals.Fig.6 Image of RNA gel electrophoresis

3 討論

近年來，超聲技術作為一種非侵入性手段，已應用于人類肝、腎活體穿刺術，定位準確、成功率高、并發癥少，彌補了傳統手術定位不準、成功率低等不足。目前尚未見利用B超引導，尤其在穿刺引導架定位下，對獼猴進行肝、腎活體穿刺獲得組織樣品的報道。由于肝內有門靜脈之類的大血管，膽囊也離肝比較近，左腎的內側有腹主動脈，右腎的內側有下腔靜脈，兩腎的內后方分別有左、右腰交感干，腎活體穿刺難度大，傳統的活體穿刺取材方式只能憑借理論上的解剖位置操作。穿刺針穿刺的深度不能過深，肝穿刺時穿刺過深容易穿透肝或刺破肝大血管甚至刺破膽囊，腎穿刺時穿刺過深容易穿刺到髓質部分，若穿刺到髓質部位將可能導致腎間質的血管損傷而出血，然解剖位置只是在標準體位下的一個參考位置，會因不同的體位和呼吸的急促性而發生改變。用傳統的活體穿刺取材方法憑借理論解剖位置和經驗在不可視的情況下進行取材，定位可能不準確，容易扎破獼猴的臟器和體內大血管、膽囊等，引起獼猴死亡，存活率沒有保障，而且該方法對操作者的要求非常高，必須有豐富的操作經驗。相對于傳統的穿刺方法，利用B超引導，尤其在穿刺引導架定位下，可對獼猴肝、腎進行較為準確的活體穿刺，以獲得組織樣品，可有效的避開膽囊、大血管，如下腔靜脈及門靜脈等重要的致命的大血管，防止動物大出血，避免因為扎破膽囊、大出血等造成的動物死亡，該方法為可視性操作，安全、定位準確、方便、快捷[11]，對操作者的要求也沒有傳統穿刺方法那么高。

與傳統的取材方式相比，活體穿刺取材的核心是“精準、快捷”[12]，活檢槍穿刺后，由于創傷小，取材速度快，只要未刺到大血管，只需為穿刺部位蓋上無菌紗布并用布腹帶把穿刺部位扎好即可。人體活檢需在穿刺結束后予穿刺處無菌紗布覆蓋按壓5～10 min，再用多頭腹帶加壓包扎[13]，而本方法在穿刺位置上用自制沙袋加壓，可避免發生皮下滲血，同時使用布腹帶包扎，能夠降低由于呼吸造成的臟器活動，避免出現肝、腎出血[14]。在術后護理過程中大大節約了人力和操作時間。

通過B超定位，尤其在穿刺引導架的引導下對獼猴進行肝、腎活體穿刺取材，定位準，可有效地避開大血管，無一例死亡，存活率達到100%，此外動物損傷小、出血少，實時、可見，所獲得的新鮮組織可直接用于提取RNA，為實驗研究的取材方式提供方便、快捷、有效手段。本方法能降低研究成本，并提高實驗室非人靈長類動物的生活質量和動物福利，同時保證實驗結果的準確性。

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