逆神經(jīng)走行方向探尋并摘取大鼠背根神經(jīng)節(jié)的改進(jìn)方法

馬理元，姜勁挺,*，張倫廣，李祥雨，鄭吉元，徐 欣，王強(qiáng)強(qiáng)

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，蘭州 730000； 2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，蘭州 730000； 3.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，蘭州 730000)

背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)作為感覺傳入的第一級換能神經(jīng)元的集中位置[1-2]，在外周信號的產(chǎn)生和傳導(dǎo)過程中有著至關(guān)重要的作用，是神經(jīng)、疼痛、骨科等多領(lǐng)域的研究對象，因此獲取完好無損的DRG成為相關(guān)研究的必要前提，但由于其特殊的解剖位置：體積小、位置深、被脊椎椎間孔所嵌頓，同時周圍有大量結(jié)締組織包繞[3]，給相關(guān)研究人員獲取DRG帶來一定難度。為短時間獲得完好DRG，本研究通過比較兩種DRG的取材方法，證明逆神經(jīng)走行方向探尋并摘取DRG這一新方法的高效性和實(shí)用性，期為背根神經(jīng)節(jié)研究提供保障。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級SD大鼠30只，雌雄各半，體重(200±10) g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供[SCXK (甘) 2015-0002]，[SYXK (甘) 2015-0005]。本實(shí)驗(yàn)福利倫理審批IACUC號：2017-095。實(shí)驗(yàn)過程中按實(shí)驗(yàn)動物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

水合氯醛，4%多聚甲醛；剃毛器，手術(shù)刀，直頭止血鉗，彎頭止血鉗，手術(shù)剪，咬骨鉗，眼科剪，眼科鑷。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 術(shù)前麻醉

大鼠術(shù)前不限制食水，10%水合氯醛按0.3 mL/kg腹腔注射。

1.3.2 傳統(tǒng)方法取材

待大鼠麻醉成功后，將其俯臥位固定于平木板上，剃毛器剔除腰部毛發(fā)，用碘伏棉球擦拭手術(shù)區(qū)，在腰部正中線和髂后上棘連線處作一縱行切口，切口向上下方向各延長2.5～3 cm，逐層切開筋膜至肌肉層，用止血鉗輕提起棘突旁的肌肉，用手術(shù)刀作一縱行小切口，用彎鉗鈍性分離脊柱兩旁的肌肉，至棘突、乳狀突、橫突充分暴露，暴露范圍根據(jù)所需DRG決定，剪掉棘突，用咬骨鉗自棘突根部蠶食性地向椎體兩旁咬去椎板，使脊髓后側(cè)、外側(cè)充分暴露后(如圖1A)，用眼科鑷將脊髓從上端緩慢、輕巧地提起后即可見到脊神經(jīng)后根分支和其在椎體的出口，咬開椎間孔后即可看到淡黃色、卵圓形的DRG，長約1.5 mm，充分暴露后，用眼科剪剪斷其兩端的神經(jīng)，將其置于盛有4%多聚甲醛溶液的離心管中。記錄每只大鼠從L3～5節(jié)段取出的完好DRG數(shù)目及其所消耗時間。

1.3.3 新方法取材

同上麻醉后切開皮膚、筋膜，暴露肌肉，分離脊柱兩旁肌肉，暴露脊柱乳狀突、橫突，同時密切觀察橫突旁肌肉中走行的神經(jīng)，并將其分離出來(如圖1B)，逆神經(jīng)走行方向，從下向上尋得神經(jīng)從椎體的出口，即橫突后緣處，用咬骨鉗將出口上下的骨質(zhì)咬去，即可暴露DRG，用眼科鑷將之前暴露的神經(jīng)鑷起，輕緩地向后外方用力，即可拉出DRG，減去其兩端的神經(jīng)，將其置于盛有4%多聚甲醛溶液的離心管中。記錄每只大鼠從L3～5節(jié)段取出的完好DRG數(shù)目及其所消耗時間。

注：A：傳統(tǒng)方法摘取大鼠背根神經(jīng)節(jié)；B：坐骨神經(jīng)走行。① 脊髓；② 背根神經(jīng)節(jié)；③ 坐骨神經(jīng)。圖1 大鼠神經(jīng)解剖圖Note. A: DRG extracted with the traditional method. B: Sciatic nerve running direction. ① Spinal cord; ② DRG; ③ Sciatic nerve.Fig.1 Anatomy of the rat nerves

1.3.4 石蠟切片及HE染色步驟

(1)取新鮮的DRG于4%多聚甲醛液固定24 h后，流水沖12 h。

(2)依次用75%～100%的乙醇連續(xù)脫水，二甲苯透明3次，浸入60℃石蠟中進(jìn)行包埋；石蠟包埋的標(biāo)本連續(xù)切片4張，厚度為4 μm，室溫干燥。背根神經(jīng)節(jié)行蘇木素-伊紅染色(HE染色)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 DRG數(shù)目和耗時差異

兩種方法均可將L3～5的DRG取出，逆神經(jīng)走行方向探尋并摘取DRG這一新方法相對于傳統(tǒng)方法更為高效，且其取得的DRG形態(tài)更為完整，數(shù)目也明顯增多(P< 0.05)。見表1。

Tab.1Comparison of the traditional method and the new method for DRG extracting

方法Methods大鼠數(shù)量Numberofrats每只大鼠取得的完整DRG數(shù)量NumberofintactDRGsextractedfromeachrat摘取每個DRG耗時(min)TimeconsumptionforextractionofaDRG傳統(tǒng)方法Traditionalmethod15308±131558±121新方法Newmethod15429±108?169±091?

注：與傳統(tǒng)方法比較，*P< 0.05。

Note. Compared with the traditional method,*P< 0.05.

2.2 形態(tài)差異

正常大鼠經(jīng)兩種方法取得DRG經(jīng)石蠟包埋、切片、HE染色后如圖2：傳統(tǒng)方法所取得的DRG(圖2 A)邊緣毛糙不清，著色不均，可能是由于取材時對DRG結(jié)締組織分離不徹底和擠壓性損傷所導(dǎo)致。新方法所取得的DRG(圖2B)組織光滑、著色均勻、結(jié)構(gòu)清晰。

注：A：傳統(tǒng)方法所取得的DRG；B：新方法所取得的DRG。圖2 正常大鼠背根神經(jīng)節(jié)石蠟切片(HE，× 40)Note. A: DRG obtained by the traditional method. B: DRG obtained by the new method.Fig.2 Histology of normal rat DRGs. HE staining

3 討論

位于外周神經(jīng)系統(tǒng)的DRG作為感覺信息傳導(dǎo)通路的第一站，位于其內(nèi)的中、小型神經(jīng)元與痛覺信息的感受和傳遞有著極為密切的關(guān)系，所以又將DRG形象地稱為痛覺感受器或傷害性感受器[4]。相關(guān)研究表明DRG在損傷或炎癥條件下因閾值下降、適應(yīng)性減弱而處于興奮狀態(tài)，這是其產(chǎn)生慢性疼痛的根本原因[5]。長期積累的慢性疼痛信號則會通過中樞神經(jīng)元形成中樞敏化，中樞敏化又會造成痛覺過敏，如此形成惡性循環(huán)[6]。因此只有深入研究DRG，才有望從根源上解決慢性疼痛。綜上，高效的DRG取材方法的探尋是極為必要的。

目前背根神經(jīng)節(jié)的取材方法有傳統(tǒng)的單獨(dú)摘取法[7]、連同脊髓同時提取法[7]、直接固定打開椎管取材法[8]，以上方法的操作中均需打開椎板、暴露脊髓后才能分離神經(jīng)根及背根神經(jīng)節(jié)，但椎板質(zhì)硬、脊髓易碎的特點(diǎn)導(dǎo)致采用傳統(tǒng)方法摘取DRG具有難度大、耗時長、易擠壓損傷DRG的弊病，而本文研究采用逆神經(jīng)走行方向探尋并摘取DRG的新方法，先分離神經(jīng)，然后沿神經(jīng)從下向上尋得神經(jīng)從椎體的出口，暴露并摘取DRG，避開打開椎板、暴露脊髓的環(huán)節(jié)，相對傳統(tǒng)取材方法不僅在取得的DRG數(shù)量上有所增加，且縮短了取材時間，同時彌補(bǔ)了傳統(tǒng)取材方法取得的DRG結(jié)締組織剔除不徹底、易擠壓損傷DRG等不足之處，值得在相關(guān)實(shí)驗(yàn)中推廣使用。

[1] 羅放, 畢好生. 神經(jīng)病理性疼痛的背根神經(jīng)節(jié)機(jī)制 [J]. 國外醫(yī)學(xué)麻醉學(xué)與復(fù)蘇分冊, 2003, 24(2): 68-70.

[2] 芮海濤, 張慶國, 徐世元. 大鼠蛛網(wǎng)膜下腔置管及背根神經(jīng)節(jié)分離方法的改進(jìn) [J]. 廣東醫(yī)學(xué), 2007, 12(28): 1915-1917.

[3] 熊南翔, 趙洪洋, 張方成. 從大鼠活體取背根神經(jīng)節(jié)及交感神經(jīng)節(jié)的方法 [J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2006, 16(6): 367-368.

[4] 褚文廣, 杜祎康, 王旭, 等. 外周傷害性感受神經(jīng)元在體特異性表達(dá)GCaMP6f蛋白方法的構(gòu)建及細(xì)胞內(nèi)鈣活動的監(jiān)測 [J]. 神經(jīng)解剖學(xué)雜志, 2017, 33(3): 323-328.

[5] Sun W, Miao B, Wang XC, et al. Reduced conduction failure of the main axon of polymodal nociceptive C-fibres contributes to painful diabetic neuropathy in rats [J]. Brain, 2012, 135(Pt 2): 359-375.

[6] Kuner R. Central mechanisms of pathological pain [J]. Nat Med, 2010, 16(11): 1258-1266.

[7] 陳海亮, 黃飛, 張璐萍, 等. 背根神經(jīng)節(jié)摘取方法的研究 [J]. 中外醫(yī)療, 2008, 28(20): 1, 3.

[8] 王士杰, 黃麗輝, 雷靂, 等. 胚胎大鼠背根神經(jīng)節(jié)摘取方法的研究 [J]. 聽力學(xué)及言語疾病雜志, 2010, 18(6): 596-597.