毛細管氣相色譜法測定山茱萸多糖的單糖組成

鄭文靜，孫 靜，張 英

山茱萸為山茱萸科植物山茱萸（Cornus of fi cinalis Sieb.et Zucc.）的干燥成熟果肉，是我國傳統中藥材。山茱萸果肉中富含蛋白質、有機酸及其酯類、糖苷類及其苷元類、鞣質類、礦物質元素和多糖等成分，其中山茱萸多糖（Cornus officinalis polysaccharide）是主要的活性物質之一。近代藥理學研究表明，山茱萸多糖不僅具有降血糖、降血脂的功效，還具有較好的免疫調節及抗氧化、抗衰老、保護心腦血管系統等生理活性[1]，可以作為保健食品、藥品，應用前景廣闊，有較高的開發價值，近年來已引起了人們的廣泛關注。

本研究分別通過分光光度法與氣相色譜法測定山茱萸多糖的糖含量與單糖組成，為進一步研究其活性和機制提供了一定的理論基礎。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 試劑及原材料

所用的標準單糖：鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸，半乳糖醛酸，木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖上海國藥集團產品；正丙胺、硼氫化鈉、咔唑苯酚、氫氧化鈉、濃硫酸、正丁醇、95%乙醇、二氯甲烷等為分析純試劑；山茱萸藥材購于西安中藥材市場，經鑒定為山茱萸科植物山茱萸（Cornus of fi cinalis Sieb. et Zucc.）的果實。

1.1.2 主要儀器

可見-紫外分光光度計Perkin Elmer Lambda 25；Shimadzu GC2010型氣相色譜儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理方法

稱取烘干粉碎的山茱萸用4倍體積的蒸餾水于30 ℃水浴中提取兩次。在提取過程中讓山茱萸浸出液保持在中性。水提液離心，取上清液減壓濃縮后，用4倍體積95%乙醇醇沉24 h，離心，沉淀用少量蒸餾水溶解，加1/5體積Sevag試劑[氯仿：正丁醇=4：1（v/v）]除去游離蛋白質。透析2天，冷凍干燥，得到水提山茱萸多糖。

1.2.2 苯酚-硫酸法測定多糖含量

分別吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7,0.8、0.9、1.0 mL標準單糖溶液于試管中，各管以蒸餾水補至2.0 mL，搖勻后分別加入50 μL 80%的苯酚與2.5 mL的濃硫酸，靜置10 min后劇烈震蕩至混勻，室溫靜置20 min，用直徑10 mm的石英比色皿于490 nm測吸光度。以2 mL水按同樣顯色操作為空白，做3組樣品取平均值[2]。橫坐標為多糖毫克數，縱坐標為吸光度值，用Original 7.0繪制葡萄糖的標準曲線（見圖1）。

圖1 以葡萄糖為標準溶液的總糖測定曲線

準確稱取山茱萸粗多糖樣品50 mg于100 mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度。準確吸取樣品液0.25 mL，相當于山茱萸粗多糖樣品0.125 mg。用同樣的方法測定吸光度值，測定粗多糖中多糖的含量。

1.2.3 衍生化法測定單糖

標準單糖衍生化[3]：稱取等摩爾的標準單糖，混合后加入1 mL水溶解，加入100 μL 0.5 mol/L Na2CO3調pH至9左右，于30 ℃水浴保溫60 min。加入0.5 mL NaBH4溶液（含40 mg NaBH4）室溫還原。加入冰醋酸中后洗脫液旋轉蒸發至干，加甲醇蒸干以除去硼酸鹽。然后加入1 mL吡啶和1 mL正丙胺，55 ℃加熱30 min。旋轉蒸發抽干溶劑，再加入吡啶和乙酸酐各2 mL，振蕩混勻，室溫過夜，然后減壓抽干溶液，樣品用氯仿溶解后，蒸餾水萃取3次，取氯仿層稀釋后進行氣相色譜分析。

樣品的衍生化：取2 mg山茱萸多糖樣品，加入2 mL 2 mol/L TFA，密閉，充氮氣，121 ℃水解2 h，減壓抽干。按照上述衍生化方法通過氣相色譜同時檢測中性糖和糖醛酸。

2 結果與分析

2.1 山茱萸多糖的含量

山茱萸經過浸泡、醇沉、除蛋白質、透析、冷凍干燥后，得到山茱萸粗多糖成分，得到的粗多糖呈紫紅色疏松片狀，得率為山茱萸生藥的1%。粗多糖采用硫酸苯酚法測定其多糖含量為70.1%。

2.2 山茱萸多糖中單糖的測定

2.2.1 氣相色譜條件

色譜柱：毛細管柱rtx-50柱（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm），氫火焰離子化檢測器 ，載氣 N2，流 速 3 0 mL/min，進樣量0.1 μL，進樣溫度230 ℃，FID 檢測器溫度230 ℃ ，程序升溫條件為：180 ℃ (2 min)，6 ℃/min；210 ℃，0.3 ℃/min；215 ℃，6 ℃/min；240 ℃ (30 min)。

2.2.2 定性定量分析

按上述色譜條件分別對標準混合單糖溶液、山茱萸多糖樣品溶液進行氣相色譜分析，將樣品圖譜與標準圖譜進行對照，根據保留時間推斷樣品中的單糖類型，根據標準圖譜計算出各單糖的響應因子，由此計算得到山茱萸多糖中單糖組成的摩爾比。標準單糖與山茱萸多糖的氣相色譜圖如圖2、圖3所示。

圖2 標準單糖衍生化產物的GC分析

根據標準圖譜計算得到各單糖的響應因子，由此得到組成單糖的摩爾比。研究結果表明，山茱萸水提取粗多糖含有鼠李糖，阿拉伯糖，葡萄糖，半乳糖和葡萄糖醛酸，其摩爾比為2.2∶30.4∶1：5.4∶2.6，是富含阿拉伯糖的酸性糖。

圖3 山茱萸多糖單糖氣相色譜

3 結語

單糖本身揮發性不強，若采用常用的氣相色譜法對其進行單糖組成分析，必須先將其轉化為易揮發而且對熱穩定的衍生物。一般在衍生化時多采用糖醇乙酸酯的衍生化方法，但該法只能檢測中性糖。在本文中我們采用將中性糖和酸性糖同時衍生化的方法，利用氣相色譜可以同時檢測到中性糖和酸性糖。研究結果表明，山茱萸多糖是富含阿拉伯糖的酸性糖。

[參考文獻]

[1] 李 晶，歐 芹，江旭東.山茱萸多糖對抗衰老模型小鼠肝組織SIRT1和p53基因表達的影響[J].中國老年學雜志，2015，35（4）：1885-1886.

[2] DUBOIS M，GILLES K A，HAMILTON J K，et al.Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J].Analytical Chemistry，1956（28）：350-356.

[3] LEHRFELD J.Simultaneous gas-liquid chromatographic determination of aldonic acids and aldoses[J].Analytical Chemistry，1985（57）：346.