正常膽囊和膽囊炎膽囊組織中的微量元素分析

宋文淵，周帥，符國珍，張劍權

（1.海南醫學院第二附屬醫院肝膽胰外科，海南 海口 570311；2.海口市人民醫院肝膽胰外科，海南 海口 570208）

膽囊炎是最常見的膽囊疾病，常與膽石癥同時存在，在腹部外科中其發病率僅次于闌尾炎。在西方國家人群中，膽囊炎膽結石的發病率普遍較高（15%～20%）[1]。我國1986年兩個大樣本人群調查，發現膽石病發病率分別為8.2%（天津）和4.4%（上海）。2000年上海地區的人群調查顯示膽囊結石病的發病率已經從原來的4%左右增加到8.5%，70歲以上年齡組更高達26.0%，發病率已接近西方國家水平[2-3]。盡管經過大量臨床和基礎研究，人們對膽道疾病的認識不斷深入，但對常見、多發的膽囊炎和膽結石的成因尚未完全搞清楚，現認為是多種因素綜合作用的結果，如肝臟膽固醇代謝紊亂、致石基因、膽囊收縮功能障礙、膽道細菌感染等[4]。雖然膽囊結石膽囊炎的發病率低于闌尾炎，但膽囊功能與闌尾相比要重要的多，并且手術切除后對人體的消化功能產生明顯的影響，已故裘法祖院士一直強調：“重視膽囊的功能，發揮膽囊的作用，保護膽囊的存在[5]”。

現研究認為人體內微量元素的功能主要包括這四個方面：穩定細胞結構、構成人體的某些結構、維持激素功能、作為酶的輔酶。近十年來微量元素在人體中的功能逐漸得到重視，但微量元素與某些疾病的確切關系還不是很明確，Yaman等[6]認為一是因為有關微量元素與疾病關系的研究還比較少，二是一些研究的結果呈現相互矛盾的結論。現國內外對微量元素的研究主要有三種：原子吸收光譜法（AAS/FAAS）、電感耦合等離子體質譜法（ICP-MS）以及同步輻射X射線熒光分析（SXRF）。但由于前兩種方法都是檢測組織微量元素的含量，對組織具有破壞性，而同步輻射X線熒光分析（SXRF）[7]由于具有靈敏度高、非破壞性、快速以及多元素同時檢測等優點，非常適合于微量元素的存在、含量、化學狀態以及存在部位的測量。本文利用中科院上海應用物理研究所同步輻射裝置（上海光源）的SR-XRF研究膽囊炎膽囊組織中的微量元素的種類和相對含量。

1 材料與方法

（1）4例腹部外傷、6例肝癌術中需切除膽囊的患者經簽署知情同意書后做為實驗對照組；按同樣標準取臨床和B超確診為膽囊結石膽囊炎且需切除膽囊18例患者經簽署知情同意書后作為實驗組。

（2）取材：手術切除膽囊后，取未被電刀切割部分暨臟面膽囊組織作為實驗取材部位，取膽囊底部和體部各大小約0.5 cm×0.5 cm作為實驗標本。

（3）固定：取材后30 min內放入10%的中性福爾馬林溶液中固定，固定液至少是標本的3倍，固定至少12 h以上；同步輻射形態學研究按病理常規脫水后干燥保存；

（4）切片：取固定好的標本冰凍，病理常規染色切片厚度為5 μm；同步輻射微量元素分析切片厚度為40 μm，并置于MYLOAR膜上封閉保存。

（5）同步輻射熒光分析（SXRF）的參數為：光子能量12 keV；流強為7.9 mA；成像距離1.3 m；投影圖像數量1 000張，即以步長0.18°在0°～180°范圍內旋轉樣品采集投影圖像；每幅投影圖像的曝光時間為3 s；CCD探測器有效像素尺寸為9 μm。

（6）同步輻射相位襯度顯微CT（μ-CT）實驗結果利用Amira 5.2.2軟件三維重建；同步輻射微量元素熒光分析后結構利用Igor和origin8.0等軟件解譜和歸一化。

2 結果

圖1是典型的基于同步輻射的正常的、膽囊炎膽囊組織的X射線熒光光譜。在不同類型的膽囊組織中，所含微量元素的種類是相同的，但含量是不同的。膽囊炎膽囊組織中的微量元素要高于正常膽囊組織。且鐵、銅、鋅及鉛的含量明顯高于其他微量元素。

圖1 正常膽囊組織、膽囊炎膽囊組織中微量元素X射線熒光光譜Figure 1 The X ray fluorescence spectroscopy of trace elements in normal gallbladder tissue and cholecystitis

進一步利用SXRF對膽囊組織進行全層掃描，光子能量12 keV；流強為7.9 mA；成像距離1.3 m；投影圖像數量1 000張，即以步長0.18°在0°～180°范圍內旋轉樣品采集投影圖像；每幅投影圖像的曝光時間為3 s；CCD探測器有效像素尺寸為9 μm。結果發現（圖2，3，4）鐵、銅、鋅及鉛主要在黏膜下層集聚。

圖2 鐵、銅、鋅及鉛在膽囊炎膽囊組織中的SR-XRF譜Figure 2 The SR-XRF spectrum of iron,copper,zinc and lead in gallbladder tissue with cholecystitis

圖3 鐵、銅、鋅及鉛在膽囊炎膽囊組織中的SR-XRF譜Figure 3 The SR-XRF spectrum of iron,copper,zinc and lead in gallbladder tissue with cholecystitis

圖4 鐵、銅、鋅及鉛在膽囊炎膽囊組織中的SR-XRF譜Figure 4 The SR-XRF spectrum of iron,copper,zinc and lead in gallbladder tissue with cholecystitis

3 討論

利用同步輻射X射線熒光分析研究正常膽囊組織（肝癌或者外傷患者術中需切除膽囊）10例和炎癥膽囊組織18例中微量元素（Fe，Ca，Zn，Pb）的含量和分布發現，其兩種組織中存在鐵、銅、鋅、鉛等微量元素,檢出率均為100%，在正常膽囊組織中，上述四種元素分布在膽囊壁的全層，而在炎癥膽囊組織，鐵和鋅主要分布于膽囊的黏膜下，而銅和鉛在膽囊壁全層均有分布。目前有關微量元素與膽囊結石的病因研究尚未見報道，比較多的研究表明，膽囊收縮素水平在膽囊結石形成中起重要作用。而相關研究表明Zn能夠對抗由于睡眠剝奪引起的大鼠大腦皮層及海馬CA1區CCK受損[8]。而降低血清CCK-8含量、提高血清Zn含量可提高動物的食欲[9]。上述研究均是間接的研究了Zn對CCK的影響，Zn是否是膽囊結石的形成的致病因素，尚需進一步的研究。而其它微量元素與膽囊結石的相關性目前尚未見報道。

與病理形態學觀察相比，同步輻射X射線相位襯度成像（Synchrotron radiation X-ray Phase Contrast Imaging,SR-XPCI）與計算機斷層掃描（CT）相結合即同步輻射X射線相位襯度CT（SR-XPCT）能獲得弱吸收樣品內部結構的二維或三維圖像，是研究生物組織的強有力工具，因此更適合從形態、結構和功能方面分析疾病的發生發展過程。

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