非小細胞肺癌中ZEB1和FoxO3a表達及意義

田亮　郭楠　苗志剛　郭效忠　張楠　彭寧寧　苗玉　張榮菊

摘 要：目的 研究E盒結合鋅指蛋白1和叉頭框家族蛋白在非小細胞肺癌組織中的表達，并探討其表達對非小細胞肺癌浸潤、轉移的影響。方法 收集2013年6月～2015年6月滄州市中心醫院手術切除的130組非小細胞肺癌腫瘤組織和癌旁正常組織，免疫組織化學法和免疫印跡法檢測E盒結合鋅指蛋白1和叉頭框家族蛋白蛋白的表達，分析E盒結合鋅指蛋白1和叉頭框家族蛋白與非小細胞肺癌臨床資料的關系。結果 腫瘤組織E盒結合鋅指蛋白1蛋白表達顯著高于癌旁正常組織（P<0.05），而叉頭框家族蛋白蛋白表達顯著低于癌旁正常組織（P<0.05）；E盒結合鋅指蛋白1和叉頭框家族蛋白蛋白表達均與腫瘤大小、分化程度、淋巴結轉移、遠端轉移以及TNM分期顯著相關（P<0.05）；在淋巴結轉移或遠端轉移的非小細胞肺癌患者中，E盒結合鋅指蛋白1蛋白表達顯著升高（P<0.05），叉頭框家族蛋白蛋白表達顯著降低（P<0.05）；高表達E盒結合鋅指蛋白1或者低表達叉頭框家族蛋白的非小細胞肺癌患者術后2年生存率顯著降低。結論 E盒結合鋅指蛋白1在非小細胞肺癌組織中高表達，叉頭框家族蛋白在非小細胞肺癌組織中低表達，兩者協同促進非小細胞肺癌浸潤轉移。

關鍵詞：FoxO3a；ZEB1；非小細胞肺癌；浸潤；轉移

中圖分類號：R734.2 文獻標識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.03.006

文章編號：1006-1959（2018）03-0016-05

Abstract：Objective To study the expression of zinc finger E binding protein 1 and forkhead box family proteins in non small cell lung cancer，and to investigate the expression of non small cell lung cancer， metastasis.Methods From June 2013 to June 2015，130 groups of non-small cell lung cancer（NSCLC）tumor tissues and adjacent normal tissues were collected from Cangzhou central hospital. Immunohistochemistry and western blotting were used to detect the expression of E-box binding zinc finger protein 1 and fork frame family protein.To analyze the relationship between E-box binding zinc finger protein 1 and fork box family protein and clinical data of non-small cell lung cancer.Results The expression of E-box binding zinc finger protein-1 protein in tumor tissues was significantly higher than that in adjacent normal tissues（P<0.05），while the protein expression of fork box family protein was significantly lower than that in adjacent normal tissues（P<0.05）.The expression of E-box binding zinc finger protein 1 and fork box family protein were significantly correlated with tumor size，differentiation，lymph node metastasis，distal metastasis and TNM stage（P<0.05）.In non-small cell lung cancer patients with lymph node metastasis or distant metastasis，the expression of E-box combined with zinc finger protein 1 （P<0.05）and protein of fork-framed family protein decreased significantly（P<0.05）.High expression patients with non-small-cell lung cancer with E-box combined with zinc finger protein 1 or with low expression of fork-frame family protein had a significantly lower 2-year postoperative survival rate.Conclusion The E-box combined with zinc finger protein 1 is highly expressed in non-small cell lung cancer tissues，and the forkhead box family protein is low expressed in non-small cell lung cancer tissues.Both of them can promote the invasion and metastasis of non-small cell lung cancer.

Key words：FoxO3a；ZEB1；Non-small cell lung cancer；Invasion；Metastasis

肺癌是我國最常見的腫瘤和致死病因，超過80%的肺癌患者為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer， NSCLC），按組織學分類，主要包括腺癌，鱗狀細胞癌和大細胞肺癌[1]。研究表明，超過90%NSCLC患者死于轉移，但目前NSCLC細胞轉移啟動的分子機制尚不明確[2]。有研究指出[3]，由連接緊密、具有細胞極性的上皮細胞逐步轉化為組織松散、缺乏細胞連接和細胞極性的間質細胞過程——上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT），使癌細胞獲得侵襲遷移能力，是轉移的先決條件。因此研究EMT相關蛋白在NSCLC組織中的表達，將有助于揭示NSCLC細胞轉移啟動的分子機制。目前研究證實，E盒結合鋅指蛋白1（ZEB1）和叉頭框家族蛋白（FoxO3a）蛋白異常表達均與腫瘤的浸潤遷移有關[4，5]，但關于ZEB1和FOXO3a在NSCLC組織表達相關性研究還較少，本文通過免疫組織化學及免疫印跡方法檢測ZEB1和FoxO3a蛋白在NSCLC組織中的表達，分析其表達與臨床病理資料的關系，探討NSCLC組織中ZEB1和FoxO3a表達的相關性及其對NSCLC浸潤轉移及預后的影響，為揭示NSCLC細胞轉移啟動分子機制提供理論依據，現報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料 收集2013年6月～2015年6月滄州市中心醫院標本130例，術前所有患者均未進行化療或放療。所有程序經過醫院倫理委員會批準，患者及家屬知情同意。非上皮源性腫瘤，轉移性腫瘤，大細胞癌和小細胞癌不在研究之列。所有病例均經三位高年資醫師按WHO肺癌分型標準進行復診[6]。其中鱗狀細胞癌38例，腺癌92例，男性79例，女性51例，淋巴結轉移80例，未轉移50例，腫瘤分期參照第8版國際抗癌聯盟（Union for International Cancer Control，UICC）[7]，I/II期88例，III期42例。每例患者包括腫瘤組織和癌旁正常組織（距離>5cm），其中每例均預留新鮮組織凍存于液氮中。

1.2主要試劑與儀器 FoxO3a兔多克隆抗體、ZEB1兔多克隆抗體和羊抗兔多克隆抗體（Abcam）；10XPBS（Hyclone，美國）；組織總蛋白提取試劑盒，雙色紅外激光成像系統（LICOR， 美國）。

1.3方法

1.3.1免疫組織化學方法檢測ZEB1和FoxO3a蛋白表達 標本經常規10%福爾馬林固定液固定，石蠟包埋，HE染色，挑選合適蠟塊，4 μm厚度白片，免疫組化采用SP法，PBS代替一抗作為陰性對照。Fox3a定位于細胞核，ZEB1定位于細胞核和細胞漿，免疫組化判定參照Yueming Zhang[8]等人標準：按陽性細胞率判斷，<25%=0分，25%-75%=1分，>75%=2分；按染色強度判斷，缺失（無色）=0分，弱（淡黃色）=1分，中度（棕黃色）=2分，強（棕褐色）=3分；以陽性細胞率評分和染色強度評分之積A≥4判定為高表達，<3判定為低表達。

1.3.2免疫印跡法檢測ZEB1和FoxO3a蛋白 將凍存于液氮的組織標本取出，參照購買的組織總蛋白提取試劑盒說明書提取組織總蛋白，測定總蛋白濃度后，依次經SDS-PAGE5%脫脂牛奶封閉、FoxO3a或ZEB1或GAPDH一抗孵育、羊抗兔二抗孵育等實驗步驟后顯色，以目的蛋白條帶灰度值/GAPDH蛋白條帶灰度值表征目的蛋白的相對表達量。

1.4統計學分析 通過SPSS20.0軟件包對研究數據進行統計學分析，計數資料（%）表示，組間比較χ2檢驗，計量資料以（x±s）表示，組間比較t檢驗，Pearson法分析兩指標間的相關性，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1免疫組化檢測ZEB1和FoxO3a蛋白表達 130例NSCLC腫瘤組織和癌旁正常組織進行免疫組化染色并進行評分，結果顯示：①ZEB1蛋白在腫瘤組織中高表達83例、低表達47例，免疫組化評分（4.02±1.56）分；ZEB1蛋白在癌旁正常組織全部呈低表達，免疫組化評分（0.94±0.78）分；②FoxO3a蛋白在腫瘤組織中高表達55例、低表達75例，免疫組化評分（2.69±1.79）分；FoxO3a蛋白在癌旁正常組織全部呈高表達，免疫組化評分為（4.97±1.00）分。

2.2 ZEB1和FoxO3a蛋白表達與NSCLC患者臨床資料的關系 130例NSCLC患者中ZEB1蛋白高表達83例，低表達47例，分析ZEB1和FoxO3a蛋白表達與NSCLC臨床資料間的關系發現：ZEB1和FoxO3a蛋白表達均與NSCLC患者性別、年齡和臨床分型無關（P>0.05），而均與腫瘤大小、分化程度、淋巴結轉移以及TNM分期顯著相關（P<0.05），見表1。

2.3 ZEB1和FoxO3a蛋白表達與NSCLC轉移的關系 130例NSCLC患者中，80例發生淋巴結轉移，50例未發生淋巴結轉移，免疫組化結果顯示：ZEB1蛋白在淋巴結轉移NSCLC患者腫瘤組織評分為（4.39±1.35）分，顯著高于淋巴結未轉移（3.42±1.70）分評分（P<0.05）；FoxO3a蛋白蛋白在淋巴結轉移NSCLC患者腫瘤組織評分為（2.44±1.57）分，顯著低于淋巴結未轉移評分（3.10±2.04）分（P<0.05）。免疫印跡檢測結果顯示：ZEB1蛋白在淋巴結轉移NSCLC患者腫瘤組織相對表達量為（1.47±0.32），顯著高于淋巴結未轉移（0.62±0.13）（P<0.05）；FoxO3a蛋白在淋巴結轉移NSCLC患者腫瘤組織相對表達量為（0.10±0.02），顯著低于淋巴結未轉移（0.81±0.14）（P<0.05），見圖1。

2.4 ZEB1和FoxO3a表達與NSCLC臨床預后的關系 130例NSCLC患者術后進行為期2年的隨訪，結果顯示：ZEB1高表達NSCLC患者術后2年生存率為48.19%，低于低表達患者65.96%術后2年生存率（P<0.05），見圖2；FoxO3a低表達NSCLC患者術后2年生存率為52.00%，低于低表達患者60.00%術后2年生存率（P<0.05），見圖3。

2.5 NSCLC組織ZEB1和FoxO3a蛋白表達的相關性 通過免疫組化法和免疫印跡法分別檢測130例NSCLC腫瘤組織ZEB1和FoxO3a蛋白表達情況：同一NSCLC患者腫瘤組織ZEB1蛋白表達越高，則FoxO3a蛋白表達越低。

3討論

腫瘤的發生發展是一個多因素調控、十分復雜的生物學過程，其中，EMT過程是腫瘤細胞獲得侵襲遷移能力的關鍵環節，獲得EMT特征的腫瘤細胞與化學藥物抵抗有關，是標準化療治療后復發和轉移的一個因素。絕大多數NSCLC肺癌患者確診時很晚，往往已出現侵襲和轉移，大約2/3的患者失去根治性手術的機會，預后差。因此，研究NSCLC細胞侵襲/遷移分子機制，不僅為NSCLC靶向性藥物的開發提供理論依據，而且將有助于準確判斷患者預后。

ZEB1又稱為TCF8或δEF1， 位于人類10號染色體短臂上，是一種胚胎早期發育所必須的轉錄因子。ZEB1可抑制上皮型標志物E-cadherin等的表達，是EMT過程中關鍵性誘導基因，促進腫瘤細胞向具有高侵襲和遷移能力的間質表型轉變[4]。近期多項研究指出，ZEB1蛋白在乳腺癌[5]、甲狀腺癌[10]、卵巢癌[11]以及肺癌[12]中均呈現高表達，并且癌細胞中高表達ZEB1可驅動EMT，進而賦予或增強癌細胞侵襲/遷移能力。仲樓等人[14]采用RT-PCR和Western Blotting方法檢測肺鱗狀細胞癌組織和腫瘤細胞株中ZEB1mRNA和蛋白的表達情況，ZEB1在肺鱗狀細胞癌組織中高表達，其表達變化與肺鱗狀細胞癌的病理特征密切相關；提示ZEB1在肺癌的發生發展中起重要作用。本研究結果相似，ZEB1蛋白在NSCLC組織中呈高表達，進一步分析ZEB1蛋白表達與NSCLC患者臨床資料關系發現，ZEB1蛋白與腫瘤大小、分化程度、淋巴結轉移、遠端轉移以及TNM分期顯著相關，并且在出現轉移的NSCLC患者中表達更高。E-cadherin蛋白具有細胞間以及細胞與基底膜相互吸附的作用，作為EMT過程中的上皮標志物，E-cadherin蛋白具有抑制腫瘤細胞遷移的作用，當E-cadherin蛋白表達減少，則預示著腫瘤細胞的遷移以及侵襲能力得到增強[13]。國內外多項研究證實[4，14]，ZEB1蛋白不僅可以通過與轉錄因子Slug結合，而且還可以被癌基因或者micro-RNA等上調表達而抑制E-cadherin蛋白的表達進而誘導腫瘤細胞EMT。

當前， FoxO3a之一是最近深入研究的關鍵蛋白，是一個抑癌基因，也是調節許多細胞功能不可缺少的轉錄因子，研究證實在多種腫瘤組織中呈現缺失表達。近幾年，FoxO3a與腫瘤EMT相關研究逐漸被人們重視，發現其通過對相關通路的抑制而對EMT過程進行調節。Ni D等[15]在透明細胞癌細胞株中研究發現，缺失表達FoxO3a可以通過上調SNAIL1蛋白表達而誘導腎癌細胞EMT，進而在體內外促進腎癌細胞的轉移；Belguise K等[16]在乳腺癌中的研究指出，FoxO3a可以通過激活ERα信號抑制乳腺癌細胞浸潤。而在肺癌中，Cheng CW等人[17]發現，FoxO3a可以通過抑制HIF-1α激活的EMT而阻礙腫瘤轉移。所以FoxO3a在NSCLC中低表達的可能是NSCLC浸潤遷移的促進因素。本研究發現，FoxO3a蛋白在NSCLC組織中呈現低表達，并且其表達與NSCLC腫瘤大小、分化程度、淋巴結轉移、遠處轉移以及TNM分期顯著相關。

ZEB1蛋白高表達和FoxO3a蛋白低表達均通過增強NSCLC細胞的侵襲遷移能力而促進NSCLC疾病進展，本研究發現NSCLC患者腫瘤組織ZEB1蛋白表達越高，則FoxO3a蛋白表達越低。雖然，目前關于FoxO3a與ZEB1在腫瘤組織中的相互作用機制還未被揭示，但是相關研究證實，PI3K/AKT不僅可以通過與SHP-2蛋白結合以驅動膠質瘤PDGFRα介導的ZEB1-miR-200反饋環[18]，還可以通過靶向調控GSK3β/β-catenin信號通路的傳導，以控制ZEB1基因轉錄，進而調控細胞角蛋白、波形蛋白和MMP2的表達[19]。同時，miR-200c通過PI3K/Akt信號通路和靶向ZEB1增強NSCLC細胞對吉非替尼的敏感性，并誘導NSCLC細胞凋亡[20]。而FoxO3a作為PI3K/AKT信號通路下游關鍵效應蛋白也可能參與腫瘤細胞ZEB1基因表達調控。

綜上所述，在非小細胞肺癌組織中FoxO3a低表達和ZEB1高表達可能通過PI3K/AKT信號通路的介導協同增強NSCLC細胞侵襲/遷移能力而促進NSCLC浸潤/遷移。

參考文獻：

[1]Chen W，Zheng R，Baade P D，et al.Cancer statistics in China，2015[J].Ca A Cancer Journal for Clinicians，2016，66（2）：115-132.

[2]王春梅，高艷麗，尹麗霞.非小細胞肺癌放射治療研究進展[J].中華腫瘤防治雜志，2017，24（10）：720-724.

[3]Seton-Rogers S.Epithelial-mesenchymal transition：Untangling EMT's functions[J].Nature Reviews Cancer，2016，16（1）：1.

[4]Yu J M，Sun W，Hua F，et al.BCL6 induces EMT by promoting the ZEB1-mediated transcription repression of E-cadherin in breast cancer cells[J].Cancer Letters，2015，365（2）：190-200.

[5]Liu H，Yin J，Wang H，et al.FOXO3a modulates WNT β-catenin signaling and suppresses epithelial-to-mesenchymal transition in prostate cancer cells[J].Cellular Signalling，2015，27（3）：510.

[6]Travis WD，Brambilla E，Mqller-Hermelink HK，et al.World Health Organization classification of tumours.Pathologyand genetics of tumours of the lung，pleura，thymus and heart[M].4th，Lyon：IARC Press；2015.

[7]Rami-Porta R，Bolejack V，Crowley J，et al.The IASLC Lung Cancer Staging Project Proposals for the Revisions of the T Descriptors in the Forthcoming Eighth Edition of the TNM Classification for Lung Cancer[J]. J Thorac Oncol，2015，10（7）：990-1003.

[8]Y Zhang，L You，J chen，et al.Expression of kinesin family member 3B is associated with poor prognosis in epithelial ovarian cancer patients[J].Int J Clin Exp Pathol，2017，10（3）：2834-2842.

[9]Guan H，Liang W，Xie Z，et al.Down-regulation of miR-144 promotes thyroid cancer cell invasion by targeting ZEB1 and ZEB2[J].Endocrine，2015，48（2）：566-574.

[10]Niu K，Shen W，Zhang Y，et al.MiR-205 promotes motility of ovarian cancer cells via targeting ZEB1[J].Gene，2015，574（2）：330-336.

[11]Larsen J E，Nathan V，Osborne J K，et al.ZEB1 drives epithelial-to-mesenchymal transition in lung cancer[J].Journal of Clinical Investigation，2016，126（9）：3219.

[12]仲樓，史加海，曹飛，等.ZEB1的表達與肺鱗狀細胞癌侵襲及轉移的關系[J].吉林大學學報（醫學版），2012，38（4）：761-765.

[13]Coopman P，Djiane A.Adherens Junction and E-Cadherin complex regulation by epithelial polarity[J].Journal of Marine Systems，2016，73（18）：3535-3553.

[14]Cappellesso R，Marioni G，Crescenzi M，et al.The prognostic role of the Epithelial-Mesenchymal Transition markers E-cadherin and Slug in laryngeal squamous cell carcinoma[J].Histopathology，2015，67（4）：491-500.

[15]Ni D，Ma X，Li H Z，et al.Downregulation of FOXO3a promotes tumor metastasis and is associated with metastasis-free survival of patients with clear cell renal cell carcinoma[J].Clinical Cancer Research An Official Journal of the American Association for Cancer Research，2014，20（7）：1779-1790.

[16]Belguise K，Guo S，Sonenshein G E.Activation of FOXO3a by the Green Tea Polyphenol Epigallocatechin-3-Gallate Induces Estrogen Receptor Expression Reversing Invasive Phenotype of Breast Cancer Cells[J].Cancer Research，2007，67（12）：5763.

[17]Cheng CW，Chen PM，Hsieh YH，et al.Foxo3a-mediated overexpression of microRNA-622 suppresses tumor metastasis by repressing hypoxia-inducible factor-1α in ERK-responsive lung cancer[J].Oncotarget，2015，6（42）：44222.

[18]Zhang L，Zhang W，Li Y，et al.SHP-2-upregulated ZEB1 is important for PDGFRα-driven glioma epithelial-mesenchymal transition and invasion in mice and humans[J].Oncogene，2016， 35（43）：5641-5652.

[19]Wu K，Fan J，Zhang L，et al.PI3K Akt to GSK3β β-catenin signaling cascade coordinates cell colonization for bladder cancer bone metastasis through regulating ZEB1 transcription[J].Cellular Signalling，2012，24（12）：2273-2282.

[20]Zhou G，Zhang F，Guo Y，et al.miR-200c enhances sensitivity of drug-resistant non-small cell lung cancer to gefitinib by suppression of PI3K Akt signaling pathway and inhibites cell migration via targeting ZEB1[J].Biomedicine&Pharmacotherapy;，2017，85（11）：113-119.

收稿日期：2017-11-10；修回日期：2017-11-13

編輯/李樺