干細胞向耳蝸毛細胞分化的研究概況

李迪 吳欣陽 吳革平

[摘要] 內(nèi)耳毛細胞作為感知和平衡聲音的主要換能器，它的形成受損或缺失都會導致不同程度的聽力障礙。在哺乳動物中，內(nèi)耳毛細胞是一種終末分化的細胞，因此毛細胞的損傷或缺失是不可再生的，造成的聽力障礙也是永久性的。目前，很多研究者希望通過體外培養(yǎng)干細胞誘導分化為毛細胞或者毛細胞樣細胞（HCLs）的方式來治療因毛細胞缺失引起的聽力障礙。雖然干細胞是有前途的細胞治療的來源，但目前很少研究能使干細胞誘導成有效的毛細胞；并且即使能誘導成毛細胞，但是成功移植并使其在正確的位置發(fā)揮正常的生理學功能也是目前面臨的一項巨大挑戰(zhàn)。在該綜述中，總結干細胞向內(nèi)耳毛細胞分化的研究現(xiàn)狀。

[關鍵詞] 感音神經(jīng)性耳聾；內(nèi)耳干細胞；胚胎干細胞；毛細胞

[中圖分類號] R4 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2018）01（b）-0196-03

[Abstract] The inner hair cells， as a major transducer of perceiving and balancing voices， its defect or loss can lead to different degrees of dysaudia. In the mammals， the inner hair cell is a kind of terminal differentiation cell， therefore， the injury or loss of hair cells is non-renewable， and the dysaudia is permanent. Currently， many researchers hope to treat the dysaudia caused by the loss of hair cells by in vitro culture of stem cells. Even though the stem cells are the origin of promising cells， there are few studies that can make the stem cells become the effective hair cells， even if it can be induced into the hair cells， the successful transplantation and making them give play to the normal physiology function in an accurate site is a great challenge， and we summarize the research status of cell differentiation from stem cells to cochlea hair cells in this paper.

[Key words] Sensorineural deafness； Inner ear stem cells； Embryonic stem cell； Hair cells

感音神經(jīng)性耳聾是聽力障礙疾病的統(tǒng)稱，主要由于先天或后天性的內(nèi)耳、聽覺神經(jīng)及聽覺中樞病變，使傳入內(nèi)耳的聲波不能被接收所引起的一種聽力障礙。人類耳蝸包含內(nèi)外兩種毛細胞， 外毛細胞對聲信號起到協(xié)調(diào)作用，內(nèi)毛細胞把外界傳入內(nèi)耳的聲信號轉換成電信號，聽覺神經(jīng)元把接收到的電信號進一步傳入聽覺通道，進而傳入聽覺中樞[1]。人類的內(nèi)耳毛細胞是一種終末分化的細胞，因此毛細胞的損傷或缺失是不可再生的，造成的聽力障礙也是永久性的[2]。研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動物的內(nèi)耳毛細胞（HC）或與其下游的蝸神經(jīng)元的損傷或丟失是導致聽力障礙的主要原因。

雖然目前臨床對于感音神經(jīng)性耳聾的治療途徑眾多，主要有助聽器、振動聲橋、人工耳蝸植入等。但這些方法都有各自的局限性，不能從根本上解決耳聾問題。為了重塑聽覺功能，研究者們把研究目標指向了生物治療——體外再生毛細胞。干細胞是具有自我更新和多種分化潛能的一種多功能細胞，因此研究者們希望通過體外培養(yǎng)干細胞，誘導其分化為內(nèi)耳毛細胞或內(nèi)耳祖細胞，然后把內(nèi)耳毛細胞重新植入耳聾患者耳蝸內(nèi)并發(fā)揮典型的內(nèi)耳毛細胞的生理學功能，從而達到治療感音神經(jīng)性耳聾目的[3]。

1 胚胎干細胞向毛細胞的分化

胚胎干細胞（ESC）是一種具有多種分化潛能的細胞，在適宜的條件下可以分化為幾乎所有的細胞類型。因此，干細胞治療成為目前研究的熱點。在早期研究中，ESC是被接種在小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）形成的滋養(yǎng)層上進行培養(yǎng)的，MEF滋養(yǎng)層可以供給ESC生長所需的營養(yǎng)，并使ESC細胞處于未分化狀態(tài)[4]。但是這種培養(yǎng)方式過程復雜、培養(yǎng)難度系數(shù)較大。此外在2D培養(yǎng)環(huán)境中，ESC細胞會直接粘附在培養(yǎng)板上；因此，它們的生長方式被限制為以平坦形狀生長，不利于模擬體內(nèi)組織器官的生長發(fā)育所需要的微環(huán)境。

近年來，根據(jù)臨床實際應用的需要Koehler KR等利用一種新的培養(yǎng)技術：3D懸浮培養(yǎng)方式，不需要MEF的一類培養(yǎng)基即MEF-free培養(yǎng)基，以Matrigel作為底物，利用一種磁性微球載體和磁懸浮技術使貼有細胞的磁性微球載體懸浮在培養(yǎng)液中，加入多種細胞因子來維持ESC的自我更新，使ESC呈三維立體形態(tài)生長[5]。這種培養(yǎng)方式突破了傳統(tǒng)的利用培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶或微孔板等2D細胞培養(yǎng)方式中的繁瑣、耗時、細胞產(chǎn)量小等局限性。這種培養(yǎng)方式就像ESC細處在胚胎中一樣，可以更好的模擬體內(nèi)胚胎發(fā)育的微環(huán)境。但是MEF-free這種培養(yǎng)方式因為成本比較高而限制了其使用率。所以，現(xiàn)在培養(yǎng)ESC使用比較多的還是基于MEF的培養(yǎng)方式。

在ESC向毛細胞分化的過程中會經(jīng)歷幾個比較典型的階段。例如，在Koehler KR的3D培養(yǎng)方式中，取E3.5的胚泡期胚胎，培養(yǎng)在LIF-2i培養(yǎng)基中，Matrigel作為底物，在E6.5的時候形成明確的外胚層；此時加入骨形態(tài)生成蛋白4（BMP4）和轉化生長因子β（TGFβ）的抑制劑SB-431542的條件下，開始沿著非神經(jīng)外胚層方向分化，在E7.5的時候形成NNE；接下來加入BMP4的抑制劑LDN-193189抑制BMP4的活性，并在生長因子FGF的作用下形成前基板外胚層，PPE隨后形成otic-epibranchialplacode domain（OEPD），OEPD在Wnt的參與調(diào)控下發(fā)育成具有含有內(nèi)耳毛細胞和支持細胞的假復層上皮的耳囊泡，并產(chǎn)生具有毛細胞靜纖毛束和毛囊的毛細胞[5]。并有研究表明，轉錄因子Emx2參與調(diào)控毛細胞的立體纖毛束取向[6]。經(jīng)過電生理檢測顯示，這些由干細胞衍生來的毛細胞具有典型內(nèi)耳毛細胞的生理學功能，并且與分化而來的感覺神經(jīng)元形成專門的突觸聯(lián)系，為內(nèi)耳器官的體外發(fā)育奠定了基礎。

2 內(nèi)耳干細胞向毛細胞的分化

2003年，Li等從成年小鼠橢圓囊感覺上皮中分離出了一類可以在體外自我更新并分化為毛細胞的細胞。他們將這類細胞命名為內(nèi)耳干細胞。后來，研究人員也逐漸從耳蝸器大上皮脊小上皮脊前庭球囊和橢圓囊感覺上皮等不同組織中分離得到了內(nèi)耳干細胞。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)耳干細胞在體外可以分化為多種類型的細胞。Li等將分離的內(nèi)耳干細胞接種在多聚賴氨酸預處理過的培養(yǎng)皿中，在無血清的條件下貼壁培養(yǎng)，14 d之后檢測細胞組分，發(fā)現(xiàn)有毛細胞標志性分子Myosin VIIA和Brn3c的表達，表明至少部分細胞已經(jīng)成功分化為內(nèi)耳毛細胞。隨后，Li等利用Myosin VIIA，Brn3c和Espin等毛細胞的特異性標記物通過免疫熒光的方法進一步證明了分化的細胞中確實有毛細胞的存在。另外，Oshiima將內(nèi)耳干細胞接種在聚賴氨酸處理過的培養(yǎng)皿中，用DMEM/F12培養(yǎng)基（含B27和N2）在體外培養(yǎng)誘導分化兩周。之后也成功檢測毛細胞的存在。還有研究證實，內(nèi)耳干細胞所處的微環(huán)境以及與相鄰細胞之間物質(zhì)交換、信號傳遞等對于內(nèi)耳干細胞誘導分化為成熟的內(nèi)耳毛細胞是至關重要的。

雖然體外已經(jīng)成功的實現(xiàn)由內(nèi)耳干細胞向內(nèi)耳毛細胞的分化，但不可忽略的是在其分化的相關過程中仍然具有很多局限性。例如內(nèi)耳毛干細胞的數(shù)目是非常有限的；并且體外培養(yǎng)過程比較復雜、培養(yǎng)難度系數(shù)大；再者其向毛細胞誘導的效率非常低，即使有部分內(nèi)耳干細胞分化產(chǎn)生毛細胞，但這些毛細胞是否具有典型毛細胞的特性和生理學功能還需要進一步的論證。

3 其他干細胞向內(nèi)耳毛細胞的分化

有研究結果顯示，間充質(zhì)干細胞在體外可以有效的分化為耳蝸毛細胞。Atoh1在間充質(zhì)干細胞向毛細胞的分化中起著重要的調(diào)控作用。當過表達Atoh1，并與螺旋神經(jīng)細胞共培養(yǎng)的條件下，體外間充質(zhì)干細胞成功分化為毛細胞[7]。另外，還有研究證明誘導多功能干細胞在合適的培養(yǎng)誘導條件下也可以完成向內(nèi)耳毛細胞的分化。說明在體外內(nèi)耳毛細胞再生的探索中，可供選擇的干細胞種類還是比較多的。

4 誘導過程中毛細胞的檢測

耳蝸發(fā)育最重要的一步是將感覺前體細胞分化為毛細胞。這一過程受到一系列的轉錄因子以及信號通路的調(diào)控，如陽性調(diào)節(jié)因子Atoh1[7]，負調(diào)控因子Hes1和Hes5[8]，細胞周期蛋白，細胞周期蛋白依賴激酶（CDK）抑制劑（CKI）等。細胞分化和退出細胞周期是發(fā)育過程中兩個緊密協(xié)調(diào)的過程。研究表明，抑制細胞周期抑制劑CKIs活性可以有助于毛細胞和支持細胞的產(chǎn)生[9]；RRD251可以破壞細胞周期調(diào)控因子Rb和Raf-1之間的物理相互作用，阻斷Rb磷酸化，使毛細胞不能正常跳出細胞周期，從而抑制內(nèi)耳毛細胞再生[10]。因此，準確鑒定和調(diào)控內(nèi)耳毛細胞發(fā)育過程中的關鍵因子有助于更準確掌握毛細胞的分化情況。Atoh1是毛細胞形成過程中不可缺少的一個“螺旋-環(huán)-螺旋”結構的轉錄因子[7]。在哺乳動物中Atoh1的表達成為檢測干細胞向毛細胞分化過程中的一個重要標志[7]。沒有表達Atoh1的前體細胞，后期不能誘導分化為毛細胞和支持細胞。在出生后早起，雖然Atoh1只在短暫的時期內(nèi)表達，但是研究結果顯示在耳蝸發(fā)育中Atoh1這種瞬時性的表達對耳蝸毛細胞的正常發(fā)育所必要的。研究顯示，Atoh1在E15.5至E17.5的表達是新生成的毛細胞存活的關鍵因素。隨后，毛細胞的成熟以及立體纖毛束的生成都離不開Atoh1的表達。以上研究表明在耳蝸發(fā)育中Atoh1是毛細胞正常分化、存活和成熟的必要條件。

在目前體外培養(yǎng)毛細胞的方法中，最終分化而來的細胞是否為毛細胞，是否具有典型毛細胞的生理活性，還需要進一步的檢測，目前主要的檢測方法有以下幾種。

①基因檢測。在體外干細胞向毛細胞的誘導中，誘導成功的毛細胞通常會檢測到Myosin VIIA，Brn3c和Espin這些蛋白的表達。因此，可以通過提取mRNA方式，檢測分子Myosin VIIA，Brn3c和Espin的mRNA表達水平，來作為一個判定是否為毛細胞的條件[11]。

②免疫熒光染色標記檢測。在內(nèi)耳干細胞向毛細胞的分化過程中，內(nèi)耳干細胞一般經(jīng)過7 d分化為內(nèi)耳祖細胞，經(jīng)過14 d形成毛細胞。這3個典型的發(fā)育階段可以通過FM1-43特異性標記后經(jīng)流式分選得到，提取這3個階段細胞的RNA做基因表達譜檢測之后，確定了這3個階段的特異性marker：內(nèi)耳毛干細胞marker（Gdf10+Ccdc121），內(nèi)耳祖細胞marker（Tmprss9+Orm1），毛細胞marker（Chrna9+Espnl[12]。因此可以免疫熒光染色的檢測可作為判定毛細胞的一個重要依據(jù)。

③膜片鉗電生理功能檢測。通過檢測分化而來的毛細胞的全細胞膜電流，K離子電流等分析此毛細胞是否具有電生理功能。

④電子掃描顯微鏡形態(tài)檢測。內(nèi)耳干細胞表面沒有靜纖維束，未成熟的毛細胞表面沒有靜纖維束或有較短的排列不規(guī)整的靜纖維束，而分化成熟的毛細胞表面有規(guī)則排列的靜纖毛束。

5 挑戰(zhàn)與展望

近年來，毛細胞的相關研究取得了巨大的突破。從細胞系的建立，到一套成熟的培養(yǎng)方式的建立，再到后來的毛細胞以及類毛細胞樣細胞的成功誘導以及分化各階段的檢測手段的建立等，都是研究者們不斷探索的成功。但是目前仍有許多挑戰(zhàn)：①毛細胞誘導率問題。毛細胞誘導率還很低。②毛細胞生理功能問題。雖然已有多種體外毛細胞檢測判定方式，但都比較片面，目前未公認的權威的判定方式來。③植入問題。即使現(xiàn)在有多種植入方式，如從圓窗、蝸軸、半規(guī)管、鼓階等，但哪種植入方式是比較有效的還有待考究。④植入后存活率以及發(fā)揮生理功能等問題都是目前面臨的困難與挑戰(zhàn)。

基于現(xiàn)有的感音神經(jīng)性耳聾的治療研究，我們推測感音神經(jīng)性耳聾的治療需要基因治療與藥物治療、基因修飾、干細胞治療甚至是與電子耳蝸植入相結合才使得臨床治療感音神經(jīng)性聾真正成為可能。

[參考文獻]

[1] 翁宇航.斑馬魚毛細胞損傷及再生研究進展[J].中華耳科學雜志， 2015，13（1）：83-86.

[2] Yoshikawa M，Y Ouji. Induction of Inner Ear Hair Cells from Mouse Embryonic Stem Cells In Vitro[J]. Methods Mol Biol，2016（1516）：257-267.

[3] 丁晨茹， 哺乳動物耳蝸毛細胞再生的研究現(xiàn)狀[J].中國眼耳鼻喉科雜志，2016，16（1）：57-59.

[4] Desai NP Rambhia， A Gishto.Human embryonic stem cell cultivation： historical perspective and evolution of xeno-free culture systems[J].Reprod Biol Endocrinol， 2015，13（1）：9.

[5] Koehler KR， E Hashino.3D mouse embryonic stem cell culture for generating inner ear organoids[J].Nat Protoc，2014，9（6）： 1229-1244.

[6] Jiang TK Kindt，DK Wu.Transcription factor Emx2 controls stereociliary bundle orientation of sensory hair cells [J]. Elife， 2017（6）：23661.

[7] 朱才高.干細胞移植治療神經(jīng)性耳聾的作用機制[J].中國醫(yī)藥指南，2013，11（8）：81-82.

[8] Su YX， CC Hou， WX Yang.Control of hair cell development by molecular pathways involving Atoh1， Hes1 and Hes5[J].Gene，2015，558（1）：6-24.

[9] Liu Q，P Chen Wang， Molecular mechanisms and potentials for differentiating inner ear stem cells into sensory hair cells [J]. Dev Biol，2014，390（2）：93-101.

[10] Lin Q.Disrupting Rb-Raf-1 interaction inhibits hair cell regeneration in zebrafish lateral line neuromasts[J]. Neuro- report，2013，24（4）：190-195.

[11] 邢蔚.miR-182可以促進耳蝸前體細胞分化為毛細胞 [J]. 中華耳科學雜志，2014，12（2）：312-315.

[12] Liu Q.Identification of stage-specific markers during differe- ntiation of hair cells from mouse inner ear stem cells or progenitor cells in vitro[J].Int J Biochem Cell Biol，2015， 60：99-111.

（收稿日期：2017-10-11）