一種新的植物泛素結(jié)合酶體外泛素化檢測(cè)方法

劉譯陽 韓燕 李國(guó)衛(wèi) 崔鳳

摘要：泛素結(jié)合酶是一類在泛素化修飾過程中起重要生物化學(xué)功能的蛋白。對(duì)于被預(yù)測(cè)為泛素結(jié)合酶的蛋白進(jìn)行體外泛素化活性檢測(cè)，是確定其泛素結(jié)合酶功能必不可少的試驗(yàn)步驟，試驗(yàn)結(jié)果可以為后續(xù)研究提供重要的線索。目前體外泛素化反應(yīng)存在體外表達(dá)純化蛋白工作量大、反應(yīng)復(fù)雜、假陰性率高等問題。本研究針對(duì)以上問題進(jìn)行了改良，開發(fā)出一種新的植物泛素結(jié)合酶活性體外檢測(cè)方法，該方法無需裂解細(xì)胞提取、純化蛋白，也不需要做體外反應(yīng)，簡(jiǎn)便易行，結(jié)果更穩(wěn)定可靠。應(yīng)用該方法對(duì)花生泛素結(jié)合酶AhUBC34和鹽芥泛素結(jié)合酶TsUBC33進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果證明這兩個(gè)蛋白都具有泛素結(jié)合酶活性。

關(guān)鍵詞：泛素結(jié)合酶；體外泛素化檢測(cè)；檢測(cè)方法；花生；鹽芥

中圖分類號(hào)：S18：Q55文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2018）03-0120-05

Abstract The ubiquitin-conjugating enzymes play key biochemical roles in the ubiquitination modification. The in vitro ubiquitination assay is essential to the study of the predicted ubiquitin-conjugating enzyme， which supplies important clues for the following study. So far， the in vitro ubiquitin-conjugating enzyme activity analysis needs huge amount of works such as protein expression and purification. The process is complex， and the ratio of false negative is high. In this study， we developed a new system to detect the plant ubiquitin-conjugating enzyme activity which omits the protein purification and in vitro reaction steps in the old method. This new system is more convenient and stable. We applied this system to detect Arachis hypogaea UBC34 and Eutrema salsugineum （Thellungiella salsuginea） UBC33， and proved the ubiquitin-conjugating enzyme activity of these two proteins.

Keywords Ubiquitin-conjugating enzyme； In vitro ubiquitination assay； Assay method； Peanut； Eutrema salsugineum

泛素（ubiquitin，Ub）介導(dǎo)的26S蛋白酶體系統(tǒng)通過參與降解生長(zhǎng)發(fā)育中不正常的蛋白為生物提供足夠的氨基酸供應(yīng)，并通過降解一些限速步驟的蛋白來精確調(diào)節(jié)生物的生理過程，為生物生長(zhǎng)發(fā)育以及應(yīng)對(duì)外界環(huán)境的變化提供便利，對(duì)生物維持正常的生理功能非常重要。泛素介導(dǎo)的26S蛋白酶體降解途徑中主要參與分子包括泛素、泛素活化酶（Ub-activating enzyme）E1、泛素結(jié)合酶 （Ub-conjugating enzyme）E2、泛素連接酶 （Ub-protein ligase）E3、26S蛋白酶復(fù)合體（26S proteasome）以及去泛素化酶（deubiquitylating enzymes，DUBs）。泛素化過程是以上幾種酶協(xié)同作用的結(jié)果。首先，泛素的C末端甘氨酸殘基在ATP存在的情況下被E1激活，激活的泛素通過硫酯鍵結(jié)合到E1的一個(gè)半胱氨酸上；然后激活的泛素再被轉(zhuǎn)移到E2蛋白的活性半胱氨酸殘基上；隨后在E3的作用下E2上的泛素共價(jià)結(jié)合到靶蛋白賴氨酸殘基上；這個(gè)過程不斷重復(fù)形成多泛素化蛋白。多泛素化的蛋白經(jīng)過26S蛋白酶體進(jìn)行降解，成為單個(gè)的氨基酸殘基，同時(shí)去泛素化酶把多泛素鏈拆解成單個(gè)的泛素，重新進(jìn)行利用[1]。其中泛素結(jié)合酶是一類在26S蛋白酶體降解途徑中起重要生物化學(xué)功能的蛋白[2]。目前的研究表明，泛素結(jié)合酶是多泛素鏈組裝的關(guān)鍵因子，控制了泛素鏈的起始和延伸，決定了底物泛素化修飾的類型和最終結(jié)果[3]。

對(duì)于預(yù)測(cè)為泛素結(jié)合酶的蛋白來說，對(duì)其進(jìn)行體外泛素化活性檢測(cè)，是確定其泛素結(jié)合酶功能必不可少的，試驗(yàn)結(jié)果可以為其后續(xù)的研究提供重要的線索。目前的泛素結(jié)合酶體外泛素化反應(yīng)體系存在如下缺點(diǎn)：泛素結(jié)合酶體外泛素化檢測(cè)所需的主要分子包括Ub、E1、E2蛋白都需要利用大腸桿菌進(jìn)行體外表達(dá)，然后裂解細(xì)胞提取蛋白，有一些還需要進(jìn)行純化，純化后的蛋白為了維持其活性需要保存在-80℃冰箱，過程復(fù)雜，工作量大。另外傳統(tǒng)的體外泛素化反應(yīng)檢測(cè)需要配制反應(yīng)緩沖液，將Ub、E1、E2等蛋白都加入反應(yīng)緩沖液中，在一定溫度和條件下進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)緩沖液中必須包含ATP以提供能量，ATP化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，反應(yīng)緩沖液難以長(zhǎng)時(shí)間保持活性；體系中加入各種蛋白的量以及反應(yīng)時(shí)間和條件也不相同，都需要各自摸索條件，工作量巨大。如果檢測(cè)不到泛素結(jié)合酶活性，無法區(qū)分是由于蛋白表達(dá)、純化、保存、凍融和反應(yīng)等步驟的問題，還是蛋白本身沒有泛素結(jié)合酶的功能，容易造成假陰性[4，5]。本研究針對(duì)以上泛素結(jié)合酶體外泛素化反應(yīng)體系存在的缺點(diǎn)進(jìn)行了改進(jìn)，研究出一種用于體外檢測(cè)泛素結(jié)合酶活性的方法，并利用該方法對(duì)花生泛素結(jié)合酶AhUBC34和鹽芥泛素結(jié)合酶TsUBC33進(jìn)行檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

LB培養(yǎng)基（1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1% NaCl，去離子水配制，高壓蒸汽滅菌）；IPTG；以上試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭７崔D(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司。表達(dá)蛋白所用大腸桿菌菌種BL21（DE3）和蛋白表達(dá)載體pGEX-6P-1由中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所謝旗研究員饋贈(zèng)。載體pACYCDuet和pCDFDuet由華南師范大學(xué)陽成偉教授饋贈(zèng)。Flag抗體（F725）購自Sigma-Aldrich公司。辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗（D110058）購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 體外泛素結(jié)合酶活性檢測(cè)體系的建立

選擇擬南芥AtUBA2作為E1[4]，構(gòu)建蛋白表達(dá)載體pGEX-6P-1-AtUBA2；選擇擬南芥AtUb[4]作為ubiquitin供體，構(gòu)建蛋白表達(dá)載體pACYCDuet-AtUb。 將pGEX-6P-1-AtUBA2轉(zhuǎn)入BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑取1個(gè)單克隆，命名為C1，保存菌種，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，將C1誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，脫色后觀察蛋白誘導(dǎo)表達(dá)情況。將上述成功誘導(dǎo)E1蛋白表達(dá)的菌種制備感受態(tài)細(xì)胞備用。

將pACYCDuet-AtUb轉(zhuǎn)入C1感受態(tài)細(xì)胞，挑取1個(gè)單克隆，命名為C2，保存菌種，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，將C2誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，脫色后觀察蛋白誘導(dǎo)表達(dá)情況。將上述成功誘導(dǎo)E1蛋白和Ub蛋白表達(dá)的菌種制備感受態(tài)細(xì)胞備用。

C1和C2株系感受態(tài)細(xì)胞即是泛素結(jié)合酶活性檢測(cè)體系的主要組分。下一步只需將待檢測(cè)E2構(gòu)建到與pGEX-6P-1和pACYCDuet復(fù)制起點(diǎn)不一樣的蛋白表達(dá)載體質(zhì)粒上，分別轉(zhuǎn)化C1和C2感受態(tài)細(xì)胞，分別誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，通過蛋白印跡方法檢測(cè)待測(cè)E2蛋白是否有符合E2+Ub分子量遷移的條帶即可。

1.3 基因擴(kuò)增及原核表達(dá)載體構(gòu)建

利用擬南芥AtUBC10上游引物5′CGGAATTCGATGGCGTCGAAGCGGATCTTG3′和下游引物5′ACGCGTCGACTCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCGCCCATGGCATACTTCTGAG3′將AtUBC10蛋白C端加上Flag標(biāo)簽并構(gòu)建到pCDFDuet載體上。

花生AhUBC34 氨基酸序列為：MAEKSCIKR

LQKEYRALCKEPVSHVVARPSPNDILEWHYVLEG

SEGTPFAGGYYYGKIKFPPEYPYKPPGISMTTPNG

RFMTQKKICLSMSDFHPESWNPMWSVSSILTGLLS

FMMDNSPTTGSVNTTTAEKQRLAKSSLSFNCKNAT

FRKMFPEYVEKYNQEQQLSEQVPPEQASSEAAPN

DTSPKVLLEKNLDSTEEGTKRVEQLKVVKKNGKQ

PFPAWMMLLLFSIFGVVMALPLLQL。據(jù)預(yù)測(cè)AhUBC34是一個(gè)跨膜蛋白，為增加蛋白的可溶性，我們利用AhUBC34上游引物5′CGGAATTCGATGGCAGAAAAGTCATGTATCAAG3′和下游引物5′ACGCGTCGACTCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCTTGCTTTCCGTTTTTCTTTACAACC3′擴(kuò)增出去掉跨膜域并在C端加上Flag標(biāo)簽的AhUBC34，之后用EcoRⅠ和SalⅠ將改造后的AhUBC34構(gòu)建到pCDFDuet載體上。

鹽芥TsUBC33的氨基酸序列為：MAEKACIKRLQKEYRSLCKEPVSHVVARPSPNDILEWHYVLEGSDGTPFAGGFYYGKIKFPAEYPYKPPGITMTTPNGRFATQKKLCLSMSDFHPESWNPMWSVSSILTGLLSFMMDNSPTTGSVNTTVAEKQLLAKSSLAFNC

KNATFRKLFPEYLEKYSQQQVAEKEEEATATQQR

TPEDSPEKDNARDESEKSVGLRKEDTKEVGLNKR

RRNKKEALPGWIIVLLVSIVGVVMALPLLQL。對(duì)鹽芥TsUBC33用同樣的方法擴(kuò)增出去掉跨膜域并在C端加上Flag標(biāo)簽的TsUBC33， 用EcoRⅠ和SacⅠ將改造后的TsUBC33構(gòu)建到pCDFDuet載體上，所用引物分別為5′-CGCGGATCCGATGGCAGAGAAAGCTTGTATAAAGC-3′和5′-CGAGCTCTCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCTTCTTT

CTTGTTCCTTCTCCTC-3′。

1.4 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)蛋白檢測(cè)

將相應(yīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3），挑取平板上的陽性菌落1～2個(gè)，接種于加入了合適抗生素的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)過夜；將培養(yǎng)好的菌液接種于50 mL加入了合適抗生素的液體培養(yǎng)基中（用150 mL錐形瓶），調(diào)OD600至0.1左右（一般需加1 mL左右菌液），37℃培養(yǎng)約80 min至OD600為0.4～0.6之間時(shí)，吸取1 mL菌液，12 000 r/min離心1 min，棄上清，液氮速凍，保存于-80℃超低溫冰箱，作為誘導(dǎo)前蛋白樣品，其余菌液中加入0.1 mol/L的IPTG至終濃度為50 mmol/L，25℃培養(yǎng)12～16 h；吸取適量菌液，以保證樣品中的細(xì)菌數(shù)目大致相近，12 000 r/min離心1 min，棄上清，液氮速凍，保存于-80℃超低溫冰箱，為誘導(dǎo)后蛋白樣品；取誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后的樣品，分別加70 μL 1×PBS，混勻，沸水浴4 min，上樣20 μL，SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后考馬斯亮藍(lán)染色，脫色觀察結(jié)果；考馬斯亮藍(lán)染色確定E1、Ub和目的片段等均有表達(dá)后，將誘導(dǎo)后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，每個(gè)點(diǎn)樣孔上樣15 μL，準(zhǔn)備進(jìn)行蛋白印跡雜交（Western Blot）。

1.5 SDS-PAGE 電泳條件

配置 12%的分離膠和5%濃縮膠，蛋白樣品與上樣緩沖液混合后沸水浴 3～5 min，冷卻后即可進(jìn)行電泳；電泳條件：穩(wěn)壓100 V；15～30 mA/板，1～2 h；電泳結(jié)束后將膠小心取下，放入考馬斯亮藍(lán) R250 搖動(dòng)染色2 h左右，然后考馬斯亮藍(lán)脫色液脫色，當(dāng)膠的背景脫色干凈后見清晰蛋白條帶時(shí)拍照。

1.6 蛋白質(zhì)印跡（Western Blot）步驟

SDS-PAGE電泳結(jié)束后從玻璃板中取出凝膠，去掉濃縮膠，保留分離膠，將其浸泡在轉(zhuǎn)膜緩沖液中，剪取與凝膠同樣大小的硝酸纖維素膜，并浸泡于膜轉(zhuǎn)移緩沖液中。在凝膠轉(zhuǎn)印夾的黑色孔板上放上纖維襯墊和濾紙，用玻璃棒趕走氣泡，之后放上膠，然后將硝酸纖維素膜蓋在膠上，輕輕滾動(dòng)玻璃棒趕走氣泡，然后依次放上濾紙及纖維襯墊。穩(wěn)壓轉(zhuǎn)膜100 V，70 min，保持低溫。膜封閉：室溫下封閉緩沖液中30 min，倒掉封閉緩沖液，加入雜交膜清洗液（TBST buffer），室溫下5 min，重復(fù)TBST Buffer一次；倒掉TBST Buffer，加入anti-Flag一抗，室溫下孵育1 h；加入TBST Buffer，室溫下5 min，重復(fù)一次，加入二抗，室溫下孵育1 h；洗膜：TBST buffer室溫洗膜2次，每次5 min；從ECL顯色發(fā)光試劑盒中各取1 mL Stock A和Stock B混合，均勻浸潤(rùn)膜；用保鮮膜封好后于Bio-Rad照膠儀器顯影。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外泛素結(jié)合酶活性檢測(cè)體系的建立

C1誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后蛋白表達(dá)情況見圖1，可以在預(yù)期位置看到明顯的AtUBA2誘導(dǎo)表達(dá)條帶。

C2誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后蛋白表達(dá)情況見圖2，可以在預(yù)期位置分別看到明顯的AtUBA2和AtUb的誘導(dǎo)表達(dá)條帶。

擬南芥泛素結(jié)合酶AtUBC10是體外泛素化檢測(cè)常用的泛素結(jié)合酶，我們以AtUBC10為例，通過上述系統(tǒng)對(duì)AtUBC10的泛素結(jié)合酶活性進(jìn)行檢測(cè)，如圖3所示，觀察誘導(dǎo)前后蛋白條帶變化，在預(yù)期分子量的位置，AtUBA2、AtUb和AtUBC10蛋白均被誘導(dǎo)表達(dá)。泛素結(jié)合酶活性結(jié)

果如圖4所示，除檢測(cè)到AtUBC10蛋白條帶外，還能夠成功檢測(cè)到另一條遷移帶，分子量符合AtUBC10加上一個(gè)Ub分子的大小，說明該檢測(cè)體系構(gòu)建成功。

2.2 花生AhUBC34泛素結(jié)合酶活性檢測(cè)

利用以上系統(tǒng)，我們檢測(cè)了花生AhUBC34的泛素結(jié)合酶活性。花生AhUBC34基因序列來源于栽培品種魯花14的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果。構(gòu)建pCDFDuet-AhUBC34蛋白表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)入BL21（DE3）細(xì)胞，挑選單克隆進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，并將誘導(dǎo)前后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色，證明AhUBC34蛋白能夠成功被誘導(dǎo)表達(dá)。隨后將pCDFDuet-AhUBC34分別轉(zhuǎn)入C1和C2感受態(tài)細(xì)胞，挑選單克隆進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，并將誘導(dǎo)前后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色，證明AtUBA2、AtUb和AhUBC34蛋白均能夠被成功誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果見圖5。將上述誘導(dǎo)前后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，隨后進(jìn)行蛋白印跡，除檢測(cè)到AhUBC34蛋白條帶外，還能夠成功檢測(cè)到另一條遷移帶，分子量符合AhUBC34加上一個(gè)Ub分子的大小，結(jié)果見圖6，證明AhUBC34具備泛素結(jié)合酶活性。

2.3 鹽芥TsUBC33泛素結(jié)合酶活性檢測(cè)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證以上泛素結(jié)合酶活性檢測(cè)方法是否可行，我們檢測(cè)了鹽芥泛素結(jié)合酶TsUBC33的活性。鹽芥TsUBC33來源于山東型鹽芥（NCBI reference sequence： XM_006402032.1）。構(gòu)建pCDFDuet-TsUBC33蛋白表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)入BL21（DE3）細(xì)胞，挑選單克隆進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，并將誘導(dǎo)前后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色，證明TsUBC33蛋白能夠成功被誘導(dǎo)表達(dá)。將pCDFDuet-TsUBC33分別轉(zhuǎn)入C1和C2感受態(tài)細(xì)胞，挑選單克隆進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，并將誘導(dǎo)前后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色，證明AtUBA2、AtUb和TsUBC33蛋白均能夠被成功誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果見圖7。將上述誘導(dǎo)前后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，隨后進(jìn)行蛋白印跡，除檢測(cè)到TsUBC33蛋白條帶外，還能夠成功檢測(cè)到另一條遷移帶，分子量符合TsUBC33加上一個(gè)Ub分子的大小，結(jié)果見圖8，證明TsUBC33具備泛素結(jié)合酶活性。

3 結(jié)論

相比現(xiàn)有的檢測(cè)方法，應(yīng)用本系統(tǒng)進(jìn)行泛素結(jié)合酶活性檢測(cè)，可以省去裂解細(xì)胞、提取蛋白的繁瑣步驟，減少在提取和保存蛋白以及蛋白凍融時(shí)造成的活性損失，減少假陰性；可以省去繁復(fù)的活性檢測(cè)步驟，無需建立體外反應(yīng)體系，無需摸索反應(yīng)條件；本系統(tǒng)提供的蛋白表達(dá)株系可以穩(wěn)定遺傳和表達(dá)，用此方法建立C1和C2后，可針對(duì)不同的E2進(jìn)行多次反應(yīng)，無需多次表達(dá)蛋白；本系統(tǒng)適用于多種植物泛素結(jié)合酶活性的檢測(cè)，對(duì)于其它物種的泛素結(jié)合酶活性檢測(cè)同樣適用，只需根據(jù)物種調(diào)整E1的種類即可。本系統(tǒng)的應(yīng)用將有力地推進(jìn)泛素結(jié)合酶功能的研究。

參 考 文 獻(xiàn)：

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