二甲雙胍丁酸鹽對人肺腺癌A549細胞增殖、凋亡與遷移能力的影響

陳晴晴，束 軍，謝慶書, 沈繼龍

雙胍類衍生物二甲雙胍是廣泛用于Ⅱ型糖尿病的降糖藥物，主要通過抑制肝糖原產生和增加肌糖原吸收調節體內血糖的平衡。2005年Evans et al[1]關于二甲雙胍可降低糖尿病患者腫瘤發病率的報道具有里程碑的意義。陸續有流行病學調查顯示二甲雙胍的治療可以減少多種癌癥如乳腺癌、前列腺癌、結腸癌、胰腺癌和肺癌的發病率[2-3]。最近的回顧性研究和Meta分析報道在服用二甲雙胍的患者中癌癥的發生率降低了31%[4]。目前，許多學者關注其抗癌作用，提出二甲雙胍或者相關的雙胍類可能具有抗腫瘤活性[5]。盡管流行病學和臨床前研究[6]顯示二甲雙胍具有抗腫瘤效果，但是只有高濃度的二甲雙胍才具有抗腫瘤活性，然而目前還不確認高濃度是否具有副作用，因此有人提出對二甲雙胍衍生物進行設計、合成并檢測[7]。近來有研究[8]表明二甲雙胍衍生物二甲雙胍丁酸鹽(metformin butyrate, MFB)，激活腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase, AMPK)，抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)，使細胞周期停滯在S和G2/M 期的效果更強。MFB具有較強的抗腫瘤活性[8]。雖然二甲雙胍在腫瘤中應用已有研究，但是二甲雙胍衍生物 MFB對肺腺癌細胞的影響鮮有報道。該研究旨在探討不同濃度的MFB作用不同時間后對A549細胞增殖、凋亡和遷移能力的影響，從而為肺癌患者的治療提供幫助。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器MFB、四甲基偶氮唑鹽(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；胎牛血清購自杭州四季青生物有限公司；RPMI-1640培養基購自美國HyClone公司；流式試劑盒購自上海貝博公司；胰酶購自上海碧云天生物技術有限公司。CO2細胞培養箱購自德國Heraeus公司;ELX800UV酶標儀購自美國Bio-Tek公司；流式細胞儀購自美國Beckman公司；超凈工作臺購自蘇州安泰空氣技術有限公司；電熱恒溫水浴鍋購自上海天平儀器廠。

1.2方法

1.2.1細胞培養 人肺腺癌細胞株A549細胞由中國科學技術大學惠贈，用含10%的胎牛血清在37 ℃、5% CO2培養箱內常規傳代培養。細胞生長到80%時棄去原有培養基，PBS沖洗，胰酶消化，顯微鏡下觀察當細胞回縮變圓時終止消化，用移液器吹打，待細胞分散成單個細胞時離心，重懸，1 ∶3傳代。當細胞處于對數生長期時用于實驗。

1.2.2MTT法檢測MFB對肺腺癌細胞A549增殖的影響 復蘇的細胞傳3代之后處于對數生長期時，用胰酶消化后加培養基終止消化，4 ℃時800 r/min下離心5 min。棄上清液，加培養基重懸，細胞計數，調整細胞濃度，每孔加100 μl使細胞最終以3×104個/ml的密度接種到96孔板，邊緣用無菌PBS填充，放于37 ℃、5% CO2孵箱過夜。實驗組加入濃度梯度的MFB(0.5、1、2、4、8 mmol/L),對照組加入等體積的培養基，每組有6個復孔。作用24、48 h后每孔加入20 μl的MTT溶液，繼續培養4 h,終止培養，小心吸去孔內培養液。每孔加入150 μl的DMSO，在搖床上低速震蕩10 min，酶標儀490 nm處測量各孔的吸光值。計算MFB對細胞增殖的抑制率，抑制率(%)=[1-實驗組吸光度(optical delnsity，OD)值]/對照組OD值×100%，實驗重復3次。

1.2.3流式細胞術檢測MFB對A549細胞凋亡的影響 將處于對數生長期的A549細胞(1×105/ml)接種于6孔板，培養24 h后棄去孔內的培養基，實驗組加入用培養基稀釋的不同濃度MFB(0.5、1、2、4、8 mmol/L)，對照組加入等體積培養基，置于37 ℃、5% CO2培養箱培養，分別于加藥24、48 h后，用胰酶和預冷的PBS 消化、離心(800 r/min離心4 min)、洗滌、收集細胞，按試劑盒說明書操作：向流式管中加入5 μl AnnexinV, FITC結合物，再加入5 μl的PI，室溫下避光培養15 min。加入400 μl的Annexin V Binding buffer，1 h內在流式儀上檢測凋亡情況。實驗重復3次。

1.2.4劃痕實驗測MFB對A549細胞遷移能力的影響 復蘇的細胞傳3代之后處于對數生長期時，接種于6孔板(接種前用記號筆在背面均勻化橫線，間隔0.5～1 cm，每孔至少穿過5條線)，待細胞貼壁長滿時用藍色槍頭畫垂直于6孔板背面平行線的直線，槍頭盡量垂直。去除培養基，加PBS清洗3～5次，去除劃下的細胞，加無血清的培養基，在顯微鏡下拍照，為0 h的劃痕寬度，棄去培養基，加入用培養基稀釋的藥物，使其濃度為2、4、8 mmol/L，對照組加入等體積的培養基，于24 h在顯微鏡下觀察拍照。然后用Image-pro plus 6.0軟件計算劃痕的寬度，則細胞遷移的距離=0 h距離-24 h距離。

2 結果

2.1MFB對A549細胞增殖的影響A549細胞在濃度梯度的MFB干預后，MTT法測量的OD值如圖1，細胞生長抑制率如表1。比較5個濃度的實驗組與對照組抑制率，差異均有統計學意義(P<0.05)。單因素方差分析顯示在同一時間段，隨著MFB濃度的增加，MFB對A549細胞增殖的抑制率增加，差異有統計學意義(P<0.05)，雙因素方差分析結果顯示在同一給藥濃度下，MFB對A549細胞的增殖抑制率48 h高于24 h，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖1 MTT法檢測MFB對A549細胞增殖的影響

組別OD490值24h48h抑制率(%)24h48h對照(0mmol/L)0.940±0.0200.940±0.0256.4±22.36.5±2.8實驗(mmol/L) 0.50.872±0.0210.804±0.07213.8±2.5*21.0±8.0* 1.00.790±0.0250.723±0.03022.4±3.1*#29.6±8.1*#▼ 2.00.717±0.0300.635±0.05030.2±3.8*△39.3±6.4*△▼ 4.00.642±0.0500.542±0.05438.1±6.0*▲48.9±7.0*▲▼ 8.00.544±0.0250.456±0.02248.6±5.6*▽58.0±3.8*▽▼

與對照組比較：*P<0.05；與0.5 mmol/L比較：#P<0.05；與1.0 mmol/L比較：△P<0.05；與2.0 mmol/L比較：▲P<0.05；與4 mmol/L比較：▽P<0.05；與24 h比較：▼P<0.05

24 h時，線性趨勢檢驗F=84.83，P<0.05；48 h時，線性趨勢檢驗F=102.52，P<0.05。綜上可以得出，MFB對A549細胞的增殖抑制作用具有一定的濃度依賴性且48 h的作用強度大于24 h。

2.2MFB對A549細胞凋亡的影響流式細胞術結果顯示，不同濃度的MFB干預24 h細胞凋亡率分別為15.87%、22.79%、27.91%、30.77%、40.65%。 48 h后凋亡率為 22.54%、22.93%、29.73%、49.82%、50.49 %。對照組為0%、10.45%。實驗組凋亡率高于對照組，并且相同濃度的MFB 48 h的凋亡率高于24 h。此外還顯示，MFB對A549細胞的促凋亡主要表現在晚期。各實驗組與對照組相比差異均有統計學意義(P<0.05)，不同濃度的MFB干預組間差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2、3。

2.3MFB對A549細胞遷移力的影響對照組細胞遷移的距離為 (58.37±2.55) μm，實驗組(2、4、8 mmol/L)遷移的距離分別為(52.47±6.21)、(31.87 ±4.65)、(21.53±4.57) μm，不同濃度MFB作用于細胞后細胞的遷移能力不同，實驗組遷移的距離小于對照組，高濃度干預組細胞的遷移距離小于低濃度組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

3 討論

眾所周知，癌癥威脅人類健康，肺癌是全球范圍內癌癥相關死亡的主要原因之一，占世界范圍內癌癥死亡的31%，盡管診斷和治療方法的完善，5年生存率仍低于15%[6]。復發、轉移、耐藥、毒副反應至今仍是治療的難點，此外，一些治療方法雖然效果相對較好，但是價格昂貴，給患者帶來較重的經濟負擔。因此，尋找新的性價比高的治療藥物迫在眉睫。小分子化學藥物對于腫瘤靶向治療和個體化治療具有重要意義。然而，小分子新藥的開發，從基礎實驗研究到臨床試驗到最終應用到臨床實踐，無疑是一個漫長的過程，需要消耗大量的時間、精力和成本。大多數藥物從實驗室研發到證實其有效性和安全性至少需要5年時間[9]。較之開發新藥，挖掘傳統非腫瘤藥物的抗腫瘤功能可能是一個捷徑[5,10]。二甲雙胍因治療糖尿病而被熟知，最近，細胞實驗和動物研究[11-12]均表明二甲雙胍還具有抗癌作用。但是其衍生物MFB的研究較少，其抗癌作用僅在乳腺癌中得到驗證[8]。在肺癌中的研究目前未見報道。從本研究的上述結果可以顯示低濃度的MFB可以明顯抑制A549細胞的增殖、遷移，促進凋亡，且作用強度存在MFB的濃度依賴性。本課題組前期研究[13]顯示高濃度的葡萄糖可以促進肺腺癌細胞的增殖、遷移。已有研究[6]顯示盡管二甲雙胍可以抑制肺腺癌細胞的生長，但只有高濃度時有效果，但此時濃度之高已超出人體耐受范圍，因此有研究[8]提出，可以對二甲雙胍結構進行改造以達到使人體可以耐受的程度。MFB的抗腫瘤作用主要通過激活LKB1/AMPK途徑、誘導細胞周期抑制和(或者)凋亡、抑制蛋白質的合成這三條途徑抑制腫瘤的生長。目前二甲雙胍主要通過激活AMPK、通過調節E鈣粘素和基質金屬蛋白酶9、基質金屬蛋白酶2、血管內皮生長因子的表達來抑制人癌細胞的遷移和侵襲等[14-17]，因此可能對肺腺癌細胞具有較好的效果。目前的研究顯示MFB可以有效抑制A549細胞的增長，促進凋亡，抑制遷移。然而本實驗只局限于一種細胞，在動物水平和臨床上的應用還有待于進一步驗證。

圖2 流式細胞術檢測MFB作用24 h后對A549細胞凋亡的影響

圖3 流式細胞術檢測MFB作用48 h后對A549細胞凋亡的影響

圖4 MFB對A549細胞遷移力的影響 ×100

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