低可利用胚胎患者的胚胎移植策略

文 琴，姜 宏，周 云，張文香

目前，體外受精-胚胎移植(invitrofertilization and embryo transfer,IVF-ET)已成為不孕癥的常規治療手段。隨著促排卵方案、培養試劑及實驗室技術的不斷發展與完善，IVF-ET過程中絕大多數患者均可獲得一定數量的優質胚胎，但不同胚胎移植時機對妊娠結局的影響尚存爭議。目前國內外多數學者多選擇受精后第3天(D3)進行新鮮周期卵裂胚移植，但部分患者由于可利用胚胎數較少，培養至D3往往因胚胎發育阻滯及質量差，導致周期取消率增加，臨床結局不理想[1]，給患者和臨床醫師均帶來極大的心理負擔。該研究對部分低可利用胚胎患者選擇D2移植，探討其臨床應用價值。

1 材料與方法

1.1病例資料選擇2015年12月～2017年2月在解放軍105醫院生殖中心接受體外受精或卵母細胞質內單精子顯微注射(invitrofertilization or intracytoplasmic sperm injection，IVF/ICSI)治療、年齡<40歲且可利用胚胎數≤3枚的不孕患者作為研究對象，共191個周期；其中受精后D3行胚胎移植92個周期，受精后D2行胚胎移植99個周期，并對其中至少曾行1次D3移植(共50個周期)的 D2移植組(41個周期)患者進行自身前后對照，比較D3與D2移植組及D2移植與既往D3移植周期的Gn用量和天數、移植日內膜厚度、獲卵數、MⅡ(metaphase Ⅱ)率、優胚率、胚胎耗損率(embryo consumption rate，ECR)、胚胎著床率、臨床妊娠率、早期流產率及異位妊娠率。

1.2IVF-ET患者采用的促排卵方案包括GnRH-a長方案、短方案及拮抗劑方案；根據卵泡發育速度及血黃體生成素、雌二醇水平酌情調整Gn用量，當2個以上卵泡直徑≥18 mm時皮下注射重組人絨促性素(商品名艾澤，德國默克雪蘭諾公司)250 μg，36～38 h行超聲引導下經陰道取卵術。2～4 h后行常規IVF或ICSI，受精后(44±1)h (D2)或(68±1)h(D3)觀察并評估卵裂期胚胎。D2或D3選擇2～3枚可利用胚胎進行移植，術后給予常規黃體支持。

1.3胚胎評分根據D2或D3胚胎形態和碎片將胚胎分為4級[2]：Ⅰ級，碎片<5%；Ⅱ級，5%≤碎片<20%；Ⅲ級，20%≤碎片<50%；Ⅳ級，碎片≥50%。以D2卵裂球細胞數目≥4的Ⅰ、Ⅱ級胚胎為優質胚胎，D3卵裂球細胞數目≥6的Ⅰ、Ⅱ級胚胎為優質胚胎。D2卵裂球數目≥2細胞Ⅲ級以上胚胎視為可利用胚胎，D3≥5細胞Ⅲ級以上胚胎視為可利用胚胎。ECR(%)=(卵裂數-移植數)/卵裂數×100%[3]。

1.4妊娠診斷胚胎移植后14 d血β人絨毛膜促性腺激素(beta human chorionic gonadotropin，β-HCG)≥20 mIU/ml為生化妊娠，移植后35 d左右B超下見胚囊確診為臨床妊娠，妊娠12周內的流產及胚胎停止發育診斷為早期流產。

1.5統計學處理采用SPSS 16.0統計軟件包建立數據庫做統計學分析。定量資料符合正態分布，組間比較采用t檢驗；不符合正態分布者，組間比較采用秩和檢驗；分類資料或率的比較采用χ2檢驗，以α=0.05為檢驗水準，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1患者基本情況由表1可見，兩組間患者年齡、不孕年限、不孕因素、曾行IVF/ICSI次數、體重指數、基礎黃體生成素(baseline luteinizing hormone，bLH)、基礎雌二醇(baseline estradiol，bE2)、基礎卵泡刺激素(baseline follicle-stimulating hormone，bFSH)及抗苗勒管激素(anti-Müllerian hormone，AMH)等差異均無統計學意義；但D2移植組的竇卵泡數(antral follicle count，AFC)顯著低于D3移植組(P<0.05)。

2.2兩組臨床結局比較由表2可見，D2移植組的獲卵數及ECR均顯著低于D3移植組(P<0.05)，且D2移植組的優胚率顯著高于D3移植組(P<0.05)，但Gn用量和天數、移植日內膜厚度、MⅡ率、移植胚胎數、胚胎種植率、臨床妊娠率、早期流產率及異位妊娠率均與D3移植組間差異均無統計學意義。

2.3D2移植組自身對照比較由表3可見，D2移植組Gn用量、Gn天數、移植日內膜厚度、獲卵數、MⅡ率、受精率、移植胚胎數及可用胚胎數與既往D3移植組差異均無統計學意義，但D2移植組的ECR及周期取消率均顯著低于既往D3移植組(P<0.05)，且胚胎種植率及臨床妊娠率均顯著高于既往D3移植組(P<0.05)。

表1 兩組患者一般情況的比較

注：*表示秩和檢驗結果Z值

表2 兩組患者臨床結局的比較

注：*表示秩和檢驗結果Z值

表3 患者D2周期與既往周期自身配對比較

注：*表示秩和檢驗結果Z值

3 討論

在體外培養過程中胚胎發育的每一個階段均可出現發育阻滯，因此通過延長胚胎體外培養時間從D2到D3甚至到D5可以通過胚胎的發育速度及形態學挑選出發育潛能更高的胚胎，改善臨床結局[4-5]。但多數胚胎在體外培養環境下處于應激狀態，只有那些適應該環境的胚胎能夠存活和生長，延長胚胎體外培養時間將增加胚胎損耗，只有部分D3優質卵裂胚(30%～50%)可形成囊胚，因未獲得囊胚或囊胚質量差導致的周期取消率增高，故囊胚移植多適用于D3優質卵裂胚較多的患者[6-7]。鑒于胚胎發育阻滯多發生于8細胞前階段，延長體外培養時間有助于選擇發育潛能更高的胚胎，且受精后D3移植胚胎較D2更接近胚胎進入子宮的生理時間，獲得更高的種植率，故目前多數學者在新鮮周期仍選擇在受精后D3進行胚胎移植[1,8]。

由于人類胚胎在8細胞以前的卵裂取決于卵細胞的質量并受母方貯存信息的控制，而8細胞之后胚胎本身的基因組轉錄被激活，控制胚胎的進一步發育，因此，無論是D2還是D3胚胎，胚胎基因組都尚未完全啟動，D3胚胎優化篩選效果值得懷疑。有研究[9-11]顯示，延長培養時間從D2至D3，胚胎評分明顯降低，且多核卵裂球明顯增多，而多核卵裂球的染色體異常率明顯增高，種植率明顯降低。另有研究[12-14]顯示，D3移植雖有更高的妊娠率，但流產率也相應增加,其活產率低于D2移植組，且將體外發育欠佳的胚胎提前移入體內可改善其發育潛能，表明子宮才是維持胚胎生長發育的最佳環境[9]。此外，體外培養時間與胚胎透明帶、表觀遺傳學及新生兒性別比的改變密切相關[15]。

在IVF促排卵過程中常由于高齡、卵巢低儲備及反應性降低、促排卵方案或Gn劑量不足等因素導致獲卵數較少，按國家衛生部176號文件(2003)限定的胚胎移植數，在D2移植后并無多余胚胎可供進一步培養、篩選。體外培養環境與體內環境尚存在某些未知的差異，延長胚胎體外培養時間將降低胚胎的發育潛能，增加胚胎損耗率，減少可移植胚胎數[16]。此外，在胚胎體外培養過程中，胚胎對pH值、溫度、滲透壓、電解質、必需氨基酸、微量元素、能源物質及多種生長因子十分敏感，任何細微的變化都可能導致胚胎損傷，影響其發育潛能，增加胚胎損耗率。因此，延長胚胎體外培養時間并不適用于所有患者，尤其獲卵數及可利用胚胎少的患者[16]。Shen et al[7]的結果表明，對于<40歲且D2移植后無剩余胚胎的患者，選擇D2移植可降低流產率，提高持續妊娠率。Bahceci et al[16]的RCT研究也證實，對于卵巢低反應患者，選擇D2移植其臨床妊娠率顯著高于D3移植。本研究結果也證實，對<40歲且D2無多余可利用胚胎的患者(≤3枚)選擇D2進行全胚胎移植，在卵巢儲備及獲卵數均顯著低于D3移植組的條件下，顯著降低了ECR，獲得了與D3移植相似的臨床結局,再次證實延長胚胎體外培養時間，增加了胚胎損耗，并不能改善臨床結局。通過對D2周期與既往D3移植周期自身配對研究，本研究顯示D2移植周期在獲卵數顯著低于既往 D3移植周期的條件下，ECR及周期取消率均顯著降低，而胚胎種植率和臨床妊娠率顯著增高，表明對于D2無多余可移植胚胎(≤3枚胚胎)的患者，選擇D2全胚胎移植，可降低ECR及周期取消率，獲得更好的臨床結局。

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