AQP8在胰腺導管腺癌中的表達及其臨床意義

趙金錢，陳 炯，方恒忠，楊旭東，朱興興，胡丕波

胰腺導管腺癌是最常見病理類型的胰腺癌，占胰腺癌患者的85%以上。胰腺癌具有發病癥狀隱蔽、早期病灶易出現周圍組織浸潤和遠處器官轉移、惡性程度極高、放化療不敏感等重要的臨床及生物學特點，到目前為止，根治性腫瘤切除手術治療是胰腺癌患者長期存活唯一有效可行的方法，但是此病患者臨床確診時多數已處于中晚期階段，喪失根治腫瘤手術時機，故該病根治性手術切除率較低、預后極差。而現有的最為廣泛使用的胰腺癌早期篩查腫瘤標志物糖抗原CA19-9(Carbohydrate atigen 19-9, CA19-9)在胰腺癌早期階段常處于正常水平，它并非是胰腺癌特異性腫瘤標志物，在肝膽胰其他類疾病中也可能升高，且胰腺癌中3%～7%的患者為Lewis抗原陰性血型結構，不表達CA19-9，因此在診斷胰腺癌方面，其敏感性和特異性并非理想，早期診斷價值有限，多用于監測胰腺癌術后腫瘤復發、轉移或療效評估。至今為止，該病的早期診斷仍缺乏特異性及敏感性均較高的腫瘤標志物，尋找胰腺癌潛在的腫瘤標志物尤為關鍵。水通道蛋白家族(aquaporins, AQPs)是一組選擇性跨膜轉運水分子的膜蛋白，即AQP0-AQP12，AQPs直接參與人類多種腫瘤的發生與發展[1-3]，水通道蛋白8(aquaporins8, AQP 8)是AQPs成員之一，但其表達與胰腺癌的臨床資料關系國內外鮮有報道，本課題組從AQP8的轉錄及蛋白質表達水平研究其在胰腺癌組織中的表達，探究其與胰腺導管腺癌臨床病理資料的相關關系。

1 材料與方法

1.1病例資料收集安徽醫科大學附屬省立醫院普外科收治行根治性手術切除，并經病理證實為胰腺導管腺癌患者的石蠟包埋的胰腺導管腺癌癌組織(pancreatic duct adenocarcinoma tissue, PC)及其相配對的癌旁正常胰腺組織(non-carcinoma adjacent tissues of pancreatic carcinoma, Non-PC)(距腫瘤組織邊緣>2 cm)各87 例(2010年1月～2013年12月)以及連續10例根治性手術切除患者的配對新鮮PC、Non-PC(2016年8月～12月)，-80 ℃凍存備用。被研究者臨床資料完整，術前均無放化療。 87 例患者中：男51例，女36例；年齡41～85(63.36±11.48)歲，< 60歲25例，≥60歲62例；胰頭部癌63例，胰體尾部癌24例；高分化18例，中低分化69例；直徑<2 cm者23例，≥2 cm的64例；TNM分期Ⅰ期40例，Ⅱ期47例；淋巴結轉移47例，未轉移40例；神經侵犯38例，未被侵犯49例。本研究得到患者的知情同意及醫院倫理委員會的批準。

1.2主要試劑TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)；逆轉錄試劑盒(美國Thermo公司)；AQP8一抗(英國Abcam公司)；二抗、免疫組化(immunohistochemistry，IHC)試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.3方法

1.3.1qRT-PCR 分別取PC及Non-PC各50 mg，提取總RNA并作為模板反轉錄生成cDNA進行qRT-PCR。以GAPDH作為內參照，F：5′-GGGAAATCGTGCGTGACATTAAGG-3′，R：5′-CAGGA AGGAAGGCTGGAAGAGTG-3′，產物大小180 bp；AQP8引物序列，F：5′-GCCTGCTTGTTGGACTGCTC-3′，R：5′-GGAATCCCACGAGCTCTGCT-3′，產物大小94 bp。

1.3.2Western blot 分別將PC及Non-PC充分裂解測總蛋白濃度。上樣量各為 50 μl，經變性、電泳、轉膜、封閉后，加入稀釋一抗(1 ∶1 000)，孵育洗滌后加入稀釋二抗(1 ∶5 000)，顯色、定影后觀察。

1.3.3IHC 石蠟包埋標本3 μm連續切片，脫蠟、抗原修復后滴加3% H2O2；滴加一抗稀釋液(1 ∶200)，4 ℃過夜，復溫后加入二抗，最后顯色、封片。評估標準采用半定量評分法[4](即低倍鏡視野下陽性著色細胞百分比及著色程度來進行評分)，如下方式分別記分：視野中無染色細胞及染色細胞占視野細胞的1%～10%、11%～50%、>50%分別記為0～3分；切片基本未著色、淡黃色、黃色、棕黃色分別計0～3分，每張切片有兩名有經驗的病理科醫師共同評分，2項得分乘積≥4即定為陽性表達。

2 結果

2.1PC、Non-PC中AQP8的mRNA表達采用qRT-PCR方法分別檢測配對的PC及Non-PC各10例，平均表達水平分別為(16.276±9.190)、(5.847±3.757)，AQP8 mRNA 的平均表達量范圍分別為 (7.57～32.79)、(1.24～12.00)。PC組 AQP8 mRNA 的表達水平明顯高于Non-PC組，差異有統計學意義(t=3.570，P<0.01)。見圖1。

2.2PC、Non-PC中AQP8的表達

2.2.1Western blot檢測AQP8的表達情況 分別檢測PC及Non-PC各10 例，有8例(80%)PC組AQP8的表達明顯高于Non-PC組，Non-PC組表達水

圖1 兩組中AQP8 mRNA表達水平比較與Non-PC組比較：**P<0.01

平均較低，PC組AQP8平均灰度值為(1.04±0.31)，顯著高于Non-PC組(0.31±0.13)，差異有統計學意義(t=8.426，P<0.001)。見圖2。

圖2 兩組中AQP8的表達水平A：PC組；B：Non-PC組

2.2.2IHC檢測AQP8的表達 檢測87例PC及相配對的Non-PC，結果顯示AQP8主要表達于PC導管細胞的細胞質中，PC組AQP8陽性表達的有69例(79.31%)，高于Non-PC組(18.39%)，差異有統計學意義(χ2=64.609，P<0.001)。見圖3。

圖3 AQP8在兩組中的表達 × 400A：PC組；B：Non-PC組

2.3AQP8與胰腺導管腺癌患者臨床病理資料間的關系IHC顯示，AQP8的表達與胰腺導管腺癌的瘤體直徑、分化程度、淋巴結轉移及TNM分期均有顯著相關性(P<0.001)。而與患者其他臨床資料之間差異無統計學意義。見表1。

表1 AQP8表達與胰腺導管腺癌臨床病理特征的相關性

3 討論

AQP8是由261個氨基酸編碼的水通道細胞質膜蛋白，AQP8在維持細胞和組織器官水電解質平衡方面起重要作用。而AQP8在胰腺導管腺癌的細胞定位與病理生理功能仍鮮為人知，本研究通過IHC檢測87例PC與Non-PC中AQP8的表達，結果表明AQP8在PC中強陽性表達，Non-PC導管細胞中幾乎不表達，Non-PC腺泡及胰島細胞團中弱表達，AQP8主要表達于PC導管細胞的細胞質中，且本研究顯示AQP8的表達與胰腺導管腺癌的瘤體直徑、分化程度、淋巴結轉移及TNM分期均有顯著相關性，而與患者其他臨床資料之間無顯著相關性。雖然AQP8在Non-PC腺泡細胞及胰島細胞團有一定表達，但進一步Western blot及qRT-PCR表明該蛋白質及其mRNA在PC中顯著高表達，而Non-PC呈現低表達狀態。這提示AQP8在PC中的強陽性表達可能與胰腺導管腺癌的發病原因存在一定的相關性，AQP8的檢測有助于評估胰腺導管腺癌的臨床病情，是新的胰腺導管腺癌早期診斷蛋白質腫瘤標志物。

AQP8與多種腫瘤的發生發展聯系密切。Zhu et al[5]利用免疫組化等方法研究了AQP8在腦星形細胞瘤中表達情況，結果表明AQP8主要表達于腦星形細胞瘤的細胞質中，在高級別星形膠質細胞瘤特別是惡性膠質瘤中顯著高表達，這提示AQP8在星形細胞瘤的分化方面起重要作用，可能是星形細胞瘤的一個生物標志物及治療靶點。Chang et al[6]研究了細胞外信號轉導激酶1/2(Erk1/2)及AQP8在宮頸上皮內瘤變、宮頸癌中的表達，結果顯示在上述兩種組織中Erk1/2及AQP8均較正常宮頸組織顯著高表達，而Erk1/2及AQP8的高表達在宮頸上皮內瘤變轉變成宮頸癌的過程中起著重要作用，且AQP8的高表達與宮頸癌細胞浸潤深度存在相關性，AQP8有可能成為宮頸癌早期診斷潛在的分子標志物。而進一步的以慢病毒為載體通過基因轉染方法提高宮頸癌Siha細胞AQP8基因的表達，能增加癌細胞侵襲和局部浸潤的能力，進一步揭示了AQP8在腫瘤發生發展中的作用[7]。

AQP8能調整細胞跨膜轉運和細胞內線粒體的滲透壓及體積變化，Marchissio et al[8]研究發現肝癌 HepG2 細胞系線粒體AQP8能促進線粒體中H2O2的釋放，而敲除肝癌細胞線粒體AQP8基因，導致線粒體內H2O2堆積及線粒體功能失調，線粒體及肝癌細胞失去了生存能力，進而引起肝癌細胞壞死而非正常凋亡，這個發現可能對于肝癌細胞的化療提供新的思路。而AQP8在胰腺導管腺癌組織中顯著高表達，也可通過類似調控AQP8的基因表達進一步探索胰腺導管腺癌治療新策略，因此AQP8有可能成為潛在的胰腺導管腺癌生物治療靶點。這些文獻實驗結果都表明AQP8在腫瘤細胞中高表達，有可能成為新的腫瘤診斷與治療的標志物。

上皮細胞-間充質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)在腫瘤的發生發展過程中發揮重要作用，與腫瘤的侵襲轉移關系密切。最新的一項實驗研究[3]表明在發生轉移的結腸癌組織中AQP8高表達，并且AQP8可以促使EMT的發生，上皮類腫瘤細胞向間質細胞轉化，進一步過表達AQP8細胞實驗顯示，實驗組腫瘤細胞穿膜數顯著高于對照組(88.0±7.2vs51.6±4.0)，這項研究[3]結果提示AQP8可能是通過促進腫瘤細胞EMT的發生，從而加速腫瘤細胞向周圍組織擴散和遠處轉移。

而Wang et al[9]利用IHC方法研究AQP8在結直腸癌組織與癌旁正常組織中的表達情況，結果表明AQP8主要表達于癌旁正常組織，癌組織無明顯表達。此實驗結果與本文AQP8在PC中高表達而在Non-PC中弱表達截然相反。

綜上所述，PC中高表達的AQP8與瘤體直徑、分化程度、淋巴結轉移及TNM分期顯著相關，這揭示了AQP8與胰腺導管腺癌的發生發展關系緊密，其病理切片IHC檢測有助于本病患者病情評估，可能是篩查早期胰腺導管腺癌的蛋白質腫瘤標志物，但其在胰腺導管腺癌發生發展中的具體機制目前尚未清楚，可能與AQP8能促進EMT的發生有關。后期課題組將會使用細胞轉染及基因敲除技術，進一步探究并闡述AQP8在胰腺導管腺癌發生發展中的作用。

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