網膜素-1對結腸癌干細胞增殖凋亡的影響及其機制研究

萬麗娟，張群慧，陳明衛，季 華

目前已公認肥胖與結腸癌密切相關，但發病機制尚不明確。近年來有研究[1]提示脂肪組織分泌的脂肪因子可能是聯系肥胖與結腸癌發生發展的關鍵因素。網膜素-1(Omentin-1)是脂肪細胞分泌的一種脂肪因子，前期臨床研究[2]結果顯示血漿Omentin-1水平與結腸癌發生密切相關，體外實驗顯示Omentin-1可促進結腸癌細胞株SW480的增殖。目前有研究[3]表明腫瘤干細胞與腫瘤的發生發展、復發轉移以及放化療抵抗有關，關于Omentin-1對結腸癌干細胞的作用目前國內外尚未見報道。該研究通過體外實驗探討Omentin-1對結腸癌干細胞增殖、凋亡的影響，為未來結腸癌的診斷和治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料人結腸癌細胞株SW480(中科院上海細胞庫)；免疫磁珠分選器及分選架(美國Miltenyi公司)；CD133間接免疫磁珠試劑盒、MS分選柱(德國Miltenyi公司)；高糖DMEM培養基、DMEM-F12培養基(美國HyClone公司)；胎牛血清(杭州四季青生物科技公司)；重組人表皮生長因子、重組人堿性成纖維生長因子(美國Peprotech公司)；B27添加物(50×)(美國Gibco公司)；白血病抑制因子(南京維森特生物技術有限公司)；磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/絲/蘇氨酸蛋白激酶(serine-threonine kinase， Akt)信號通路抑制劑(LY294002)(上海碧云天生物技術研究所)；CCK-8細胞增殖試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒(上海貝博生物公司)；Omentin-1(武漢優爾生公司)。

1.2結腸癌干細胞免疫磁珠分選用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的高糖DMEM培養基，在37 ℃、5%CO2培養箱中培養SW480結腸癌細胞。取生長對數期的SW480結腸癌細胞，胰酶消化后細胞計數2×107個，離心后棄上清液，使用350 μl含0.5%胎牛血清、2 mmol/L 乙二胺四乙酸的緩沖液重懸，形成單細胞懸液。依次加入受體阻斷劑100 μl和CD133/1(AC133)-Biotin 抗體50 μl，混勻后置于4 ℃冰箱孵育10 min，加入緩沖液5 ml清洗2遍，后以1 330 r/min離心10 min，棄去上清液，重懸于400 μl緩沖液中，加入100 μl抗Biotin微珠，4 ℃冰箱孵育15 min。再次用緩沖液清洗細胞2次，并充分重懸于500 μl緩沖液中備用。將標記好的CD133抗體的細胞懸液加入安裝好的分選柱中，待細胞懸液自然流盡，PBS洗柱3次，每次均自然流盡，從磁場中取下分選柱，用1 ml PBS快速沖洗分選柱中細胞，收集于培養板中，即為CD133+結腸癌干細胞。

1.3CD133+結腸癌干細胞的培養將CD133+結腸癌干細胞接種于超低黏附6孔板中，每孔加入2 ml DMEM-F12無血清培養基，37 ℃、5%CO2溫箱中孵育，采用離心換液法每3 d更換新鮮培養基，當細胞培養至對數生長期，倒置顯微鏡下觀察多數細胞形成干細胞球時(80%)進行傳代。

1.4結腸癌干細胞的鑒定結腸癌干細胞培養至對數生長期，收集細胞離心后棄上清液，用PBS清洗2次并離心，接種于96孔板中，加入含10% 胎牛血清的高糖DMEM培養基誘導細胞分化，觀察干細胞分化貼壁情況。同時將對數生長期的結腸癌干細胞消化重懸為單個細胞，分為陰性對照組和CD133組，每組計數2×106個細胞，PBS清洗2次后，加入500 μl PBS重懸細胞。陰性對照組只加2 μl PE染色，4 ℃避光孵育，不加CD133抗體，而CD133組先加入CD133抗體2 μl，4 ℃冰箱避光孵育1 h后，用PBS清洗1次，再加入PE 2 μl染色，4 ℃避光孵育15 min后。立即用流式細胞儀檢測兩組CD133含量。

1.5實驗分組觀察不同濃度Omentin- 1對結腸癌干細胞增殖、凋亡的影響，并探討Omentin- 1對PI3K/Akt信號通路的影響，實驗分為5組：對照組、Omentin 1組(1 μg/ml Omentin-1)、Omentin 2組(2 μg/ml Omentin-1)、Omentin LY組(1 μg/ml Omentin-1和50 μmol/L LY294002)、LY組(50 μmol/L LY294002)，每組設4個復孔。

1.6CCK-8法檢測結腸癌干細胞增殖情況將對數生長期的結腸癌干細胞以1.5×105個接種于96孔板中，每孔加入100 μl培養基，按分組條件干預細胞24 h后，每孔加入10 μl CCK-8，避光孵育3 h，酶標儀450 nm處檢測吸光度(optical density，OD)值，實驗重復3次。為進一步了解Omentin-1對結腸癌干細胞增殖的時間效應關系，應用1 μg/ml Omentin-1分別干預0、1、6、24、48 h后，加入CCK-8試劑10 μl，避光孵育2 h，酶標儀450 nm處檢測OD值，實驗重復3次。

1.7流式細胞儀檢測結腸癌干細胞凋亡情況取對數生長期的結腸癌干細胞以每孔2×106個接種在6孔板中，每孔2 ml DMEM-F12培養基，按分組條件干預細胞24 h后，收集細胞后800 r/min離心5 min，PBS清洗2次，細胞重懸于400 μl結合液，5 μl Annexin V-FITC混勻，4 ℃避光孵育15 min，再加入10 μl PI 4 ℃避光孵育5 min，立即用流式細胞儀檢測，實驗重復3次。采用Flowjo V7軟件分析結果。

1.8Westernblot檢測不同濃度Omentin-1干預后Akt、pAkt蛋白表達取對數生長期的結腸癌干細胞，每孔2×107個接種于6孔板中，按分組條件干預，培養24 h后收集細胞并提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。加入25 μl蛋白上樣緩沖液(5×)。按實驗分組依次將蛋白上樣，電泳1 h分離，200 mA穩流2 h轉移至NC膜上。5%封閉液封閉1～2 h，TBST緩沖液洗膜3次，分別加入β-actin(1 ∶2 000)、Akt(1 ∶1 000)、p-Akt(1 ∶1 000)，4 ℃孵育一抗過夜，洗膜3次，5%封閉液加入二抗1 μl(1 ∶8 000)，搖床上低速室溫孵育二抗1 h，再次洗膜3次后滴加顯影液顯影。Quantity One凝膠成像軟件分析相對灰度值。

2 結果

2.1結腸癌干細胞鑒定克隆球形成：應用倒置顯微鏡觀察，結腸癌干細胞在無血清培養基中培養，第1天可見小的干細胞球形成，數量少；第5天可見明顯干細胞球形成；第10天干細胞球進一步增大且變圓；干細胞球在無血清培養基中呈懸浮生長，見圖1。

分化實驗結果：應用倒置顯微鏡觀察，結腸癌干細胞接種于含10%胎牛血清培養基中，第3天仍可見干細胞球，大部分懸浮生長，小部分細胞從細胞球中逸出貼壁呈梭形；第7天大部分干細胞球逐漸貼壁，呈梭形；第9天干細胞球全部分化成為梭狀的結腸癌SW480細胞，呈貼壁生長，且梭形細胞數量較第7天時增多，見圖2。

流式細胞儀檢測CD133結果：結腸癌干細胞表面標志物CD133+細胞群含量達80.3%，見圖3。

2.2Omentin-1對結腸癌干細胞增殖的影響與對照組比較，Omentin 1組、Omentin 2組、Omentin LY組、LY組OD值均明顯降低(F=37.068，P<0.05)；Omentin 2組、Omentin LY組的OD值較1 μg/ml Omentin-1作用于結腸癌干細胞0、1、6、24、48 h后，隨干預時間增加，OD值呈逐漸下降趨勢，差異有統計學意義(F=126.009，P<0.05)。

圖1 倒置顯微鏡下觀察結腸癌干細胞球生長 ×400A：第1天；B：第5天；C：第10天

圖2 倒置顯微鏡下觀察結腸癌干細胞分化情況 ×200A：第3天；B：第7天；C：第9天

圖3 流式細胞儀鑒定結腸癌干細胞表面標志物CD133PE-CD133+：CD133陽性細胞群

Omentin 1組更低，Omentin LY組 OD值低于LY組，差異均有統計學意義(F=37.068，P<0.05)，見圖4。

2.3Omentin-1對結腸癌干細胞凋亡的影響Omentin 1組、Omentin 2組、Omentin LY組、LY組的細胞凋亡率分別為(17.10±0.86)%、(36.52±1.26)%、(34.35±4.21)%、(23.08±4.99)%，與對照組(5.75±3.48)%比較均上升，差異有統計學意義(F=42.305，P<0.05)。Omentin 2組、Omentin LY組的細胞凋亡率較Omentin 1組更高，Omentin LY組的細胞凋亡率高于LY組，差異均有統計學意義(F=42.305，P<0.05)，見圖5。

2.4Omentin-1對pAkt/Akt表達的影響與對照組相比，隨著Omentin-1濃度的增加， Akt蛋白表達量有所下降，pAkt蛋白表達量呈明顯下降趨勢， pAkt/Akt比值逐漸下降。與對照組相比，Omentin 1組pAkt/Akt表達降低，但差異無統計學意義，而Omentin 2組則顯著降低(F=5.200，P<0.05)，見圖6。

圖4 不同濃度Omentin-1對結腸癌干細胞活力的影響及與LY294002的相互作用

A：對照組；B：Omentin 1組；C：Omentin 2組；D：Omentin LY組；E：LY組；與對照組比較：*P<0.05；與Omentin 1組比較：#P<0.05；與Omentin LY組比較：△P<0.05

圖5 流式細胞儀檢測細胞凋亡A：對照組；B： Omentin 1組；C： Omentin 2組；D： Omentin LY組；E：LY組

圖6 Omentin-1對pAkt/Akt表達的影響

A：對照組；B：Omentin 1組；C：Omentin 2組；與對照組比較：*P<0.05

3 討論

Omentin-1是一種新型的分子量為34 ku的脂肪因子，主要表達于腹部脂肪組織的脂肪細胞中。已有研究[4-5]表明Omentin-1可能與一些惡性腫瘤，如胃癌、神經母細胞瘤等的發生發展存在密切聯系。

Omentin-1與結直腸癌(colorectal cancer，CRC)之間也存在相關關系。本課題組前期研究[6]顯示CRC患者和正常受試者血漿Omentin-1水平均與高密度脂蛋白呈正相關性，與三酰甘油、空腹胰島素、腰臀比等呈負相關性。結腸癌患者癌組織中Omentin-1蛋白表達和mRNA水平高于癌旁組織，從結腸癌SW480細胞的細胞裂解液中檢測出Omentin-1蛋白及mRNA表達，SW480細胞上清液中檢測到Omentin-1蛋白表達[7]。體外實驗顯示Omentin-1可促進SW480結腸癌細胞增殖，抑制其凋亡[2]。CRC患者的血清Omentin-1、內脂素、絲氨酸蛋白酶抑制劑水平明顯升高，并且這些脂肪因子可能通過各種機制對CRC發展直接產生作用，這種直接作用甚至有可能比通過肥胖與CRC之間聯系的間接作用更重要[8]。也有前瞻性群組研究[9]表明，CRC患者血循環網膜素水平升高，提示Omentin-1與CRC風險增加有關，表明Omentin-1可以作為預測CRC風險的新型標志物。但是，有研究[10]顯示無糖尿病的Ⅲ期結腸癌患者進行手術和奧沙利鉑、5-氟尿嘧啶等化學藥物治療后，Omentin-1水平明顯升高。TMEM207是一種不典型的跨膜蛋白，與Omentin-1的產生有關，在CRC細胞中用小干擾RNA使TMEM207基因沉默后，Omentin-1多聚泛素化增加、蛋白酶體降解，從而使Omentin-1分泌減少，結果可導致結直腸發生癌變，Omentin-1水平的下調可能導致進展期CRC患者預后不良[11]。雖然目前關于Omentin-1對結腸癌細胞的作用尚有相關報道，但對結腸癌干細胞的作用的研究未見報道。

結腸癌干細胞是結腸癌細胞中的一小部分細胞群，具有自我更新、無限增殖和多向分化的特性以及致瘤性。目前腫瘤干細胞的分選方法主要使用免疫磁珠法和流式細胞儀分選法，免疫磁珠法是國際公認的干細胞分選方法，操作簡便、分選出的陽性細胞比例高。結腸癌干細胞的表面標志物包括CD133、CD44、LGR5等，其中CD133是結腸癌干細胞最具代表性的表面標志物之一。

本實驗首先通過間接免疫磁珠分選法從結腸癌細胞株SW480中分選出CD133+結腸癌干細胞，采用克隆球形成實驗和分化實驗證實免疫磁珠分選及無血清培養基培養的CD133+干細胞具有腫瘤干細胞的無限增殖和多向分化能力，并通過流式細胞儀鑒定分選后細胞中CD133含量達80.3%，與相關研究[12-13]結果一致。通過不同濃度Omentin-1和不同時間點作用于結腸癌干細胞后顯示，Omentin-1可抑制結腸癌干細胞增殖，促進其凋亡，且這種作用呈時間-濃度依賴性。此外，本研究還顯示Omentin-1與LY294002共同作用于結腸癌干細胞后，抑制增殖及促進凋亡作用均較單一作用時加強，具有協同作用。

絲蘇氨酸蛋白激酶/蛋白激酶B屬于PI3K信號通路。PI3K信號通路是刺激生長因子的核心信號通路，PI3K通過其下游分子Akt活化后刺激各種惡性腫瘤細胞內信號，抑制腫瘤細胞凋亡，促進增殖；反之，Akt信號通路抑制可以使一些惡性腫瘤細胞凋亡。在很多腫瘤中都顯示存在PI3K/Akt通路異常，如非小細胞肺癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌，Akt信號通路激活在結腸癌細胞的增殖和凋亡中也起重要作用。LY294002是PI3K/Akt通路的抑制劑，可降低Akt蛋白的磷酸化水平，從而誘導結腸癌細胞凋亡、抑制其增殖，可能用于治療結腸癌[14]。本實驗結果顯示，Omentin-1可以抑制pAkt/Akt活性，其抑制結腸癌干細胞增殖、促進其凋亡的機制可能與抑制Akt活性有關，與胃癌[4]、神經母細胞瘤[5]的研究結果一致，并且與LY294002的作用一致。然而有研究[15]顯示，Omentin-1可以在胰島素存在或缺乏的情況下，觸發Akt通路，通過激活腺苷單磷酸活化蛋白激酶和Akt磷酸化途徑抑制心肌細胞凋亡，從而阻止心肌細胞急性缺血性損傷。推測Omentin-1在不同細胞中對Akt途徑的作用可能并不相同。

綜上所述，Omentin-1抑制結腸癌干細胞增殖、促進其凋亡，呈時間濃度依賴關系，且Omentin-1與LY294002在抑制結腸癌干細胞增殖、促進其凋亡的過程中具有協同作用。另外Omentin-1對結腸癌干細胞的作用機制可能與抑制Akt通路有關。

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