BMP-7誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞分化的初步研究

白廣超，金宏亮，雷 堃，李寬新

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)存在于骨髓基質(zhì)中，具有取材方便、來源廣泛的特點(diǎn)，是組織工程中理想的種子細(xì)胞[1]。BMSCs是來源于中胚層的多能干細(xì)胞，在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下可以向骨、軟骨及心肌細(xì)胞分化。近期研究[2]表明，BMSCs還具有跨胚層分化的能力，可以向外胚層的神經(jīng)細(xì)胞分化，這一發(fā)現(xiàn)得到了脊髓損傷研究領(lǐng)域的高度關(guān)注。因此，BMSCs在脊髓損傷的細(xì)胞移植治療中具有重要的研究意義及臨床應(yīng)用價(jià)值。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(bone morphogenetic protein 7，BMP-7)是β轉(zhuǎn)化因子超級家族中的一員，最早是由于其出色的成骨誘導(dǎo)特性被發(fā)現(xiàn)的。目前研究[3]表明BMP-7在哺乳動物的神經(jīng)組織中也有表達(dá)，并在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中發(fā)揮了重要的作用。胡嵐翔 等[4]在研究中發(fā)現(xiàn)，BMP-7在正常脊髓組織中的表達(dá)量很微弱，在大鼠脊髓損傷后表達(dá)量增加，在脊髓損傷的早期起到了保護(hù)作用。該研究以BMP-7為誘導(dǎo)劑在適宜的條件下誘導(dǎo)大鼠BMSCs，探討B(tài)MP-7是否具有誘導(dǎo)大鼠BMSCs向神經(jīng)元細(xì)胞分化的能力，為脊髓損傷的細(xì)胞移植治療開辟一條新的途徑。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物SD大鼠(10只，雄性，4～6周齡，100 g左右，SPF級)由石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。大鼠給予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，適應(yīng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所有實(shí)驗(yàn)在符合動物實(shí)驗(yàn)倫理要求下進(jìn)行。

1.2主要試劑BMP-7(美國R&D公司)；DMEM-HG培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(奧地利PAA公司)；雙抗、胰蛋白酶(美國Hyclone公司)；L-維生素C、吲哚美辛(青島捷世康生物科技有限公司)；B27(北京Engreen公司)；NF-200鼠抗(Mouse Anti-NF200)、SYN-1兔抗(Rabbit Anti-Synapsin 1)、SABC免疫組化染色試劑盒、DBA顯色劑(武漢博士德公司)；胰島素(美國Sigma公司)；地塞米松(上海永葉生物科技有限公司)；CD29、CD44流式抗體(美國BioLegend公司)。

1.3主要儀器熒光倒置相差顯微鏡(德國蔡司公司)；流式細(xì)胞儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Thermo Scientific公司)；水浴鍋(上海博迅公司)；CO2培養(yǎng)箱(北京阿爾泰科技發(fā)展有限公司)；純水器(成都超純科技有限公司)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1大鼠BMSCs的提取、分離和培養(yǎng) 取1只SD大鼠，進(jìn)行稱重、記錄，以頸椎脫臼法處死，腹部剪“十”字后，打開腹腔，逐漸分離出股骨及脛骨，分離出的股骨、脛骨放入75%酒精中浸泡5 min后再放入PBS內(nèi)，轉(zhuǎn)入生物安全柜，組織剪剪除股骨、脛骨兩端，露出骨髓腔，2.5 ml注射器抽取完全培養(yǎng)液交替沖洗骨頭兩端，直至骨頭呈現(xiàn)為透明。收集細(xì)胞懸液，反復(fù)吹打。細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107個(gè)/ml接種至25 cm2培養(yǎng)瓶中， 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

細(xì)胞培養(yǎng)至48 h后進(jìn)行半換液，隨后每3 d進(jìn)行全換液。待到細(xì)胞融合至80%左右時(shí)以0.25% 胰蛋白酶進(jìn)行消化，按1 ∶2進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.4.2流式細(xì)胞儀檢測大鼠BMSCs表面標(biāo)志物 取第3代大鼠BMSCs 1×106個(gè)細(xì)胞進(jìn)行CD29-PE，CD44-FITC染色，以不含抗體的細(xì)胞為陰性對照組，避光、室溫環(huán)境孵育30 min，隨后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.4.3大鼠BMSCs成脂誘導(dǎo)及油紅O染色鑒定 成脂誘導(dǎo)：取培養(yǎng)至第3代的大鼠BMSCs接種至6孔板，按2×105個(gè)/孔進(jìn)行接種，培養(yǎng)至24 h加入成脂誘導(dǎo)液(94.498%DMEM+4%FBS+1%雙抗+0.4%地塞米松+0.1%胰島素+0.002%吲哚美辛)，每3 d進(jìn)行全換液及倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。誘導(dǎo)至28 d，進(jìn)行油紅O染色鑒定脂肪細(xì)胞。

油紅O染色：儲備液和稀釋液按照5 ∶2混勻后用漏斗過濾，以PBS洗細(xì)胞兩遍，加應(yīng)用液，15 min后棄去應(yīng)用液，以PBS洗2遍，純水洗2遍，加復(fù)染液進(jìn)行復(fù)染，5 min后棄去復(fù)染液，PBS洗2遍，純水洗3遍，滴加封固劑進(jìn)行封片，置于倒置相差顯微鏡下觀察。

1.4.4MTT法檢測不同濃度BMP-7對BMSCs增殖的影響 取第3代BMSCs，分為調(diào)零組、對照組(DMEM+FBS)、BMP-7干預(yù)組(DMEM+FBS+25、50、75、100 ng/ml BMP-7)，設(shè)置6個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。調(diào)整細(xì)胞懸液密度接種到96孔板，每孔種8×103個(gè)細(xì)胞，補(bǔ)充培養(yǎng)液至200 μl，邊緣孔用無菌生理鹽水填充，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后換各組對應(yīng)的培養(yǎng)液。隨后每天測定A490 nm：每孔加入20 μl MTT 溶液(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去培養(yǎng)液后每孔加入150 μl 二甲基亞砜。置于酶聯(lián)免疫檢測儀中，設(shè)置震蕩10 min，測各孔490 nm處吸光度，繪制曲線。

1.4.5大鼠BMSCs的誘導(dǎo)分化 取第3代大鼠BMSCs，調(diào)整密度為4×104個(gè)/ml接種到48孔板，每孔接種500 μl細(xì)胞懸液，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)2 h后，棄去培養(yǎng)液，換為誘導(dǎo)液，細(xì)胞隨機(jī)分為3組：① 陰性對照組：DMEM-HG+10%胎牛血清；② 陽性對照組：DMEM-HG+β-巰基乙醇(5 mmol/L)；③ BMP-7誘導(dǎo)組：DMEM-HG+BMP-7(75 ng/ml)。各組細(xì)胞誘導(dǎo)開始后每隔1 h置于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.4.6免疫組化法檢測各實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)元標(biāo)志物NF-200及SYN-1的表達(dá) 取各實(shí)驗(yàn)孔，棄誘導(dǎo)液，冰的4%多聚甲醛室溫下固定30 min，PBS沖洗5 min×3次。3% H2O2室溫浸泡30 min，蒸餾水沖洗5 min×3次，滴加5%BSA封閉液，室溫20 min，棄多余液體，加一抗(NF-200、SYN-1)，4 ℃過夜。PBS沖洗2 min×3次，滴加二抗，室溫孵育20 min，PBS沖洗2 min×3次，滴加試劑SABC，室溫孵育20 min。隨后進(jìn)行DAB顯色，蘇木精輕度復(fù)染染核約1 min，用1% HCl酒精洗滌10 s。酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，在倒置相差顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1大鼠BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察骨髓細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶后，細(xì)胞呈圓型，大小不一，懸浮于培養(yǎng)液中。2 d半換液后可見部分細(xì)胞已貼壁，貼壁細(xì)胞呈短梭形或多角形。第5天進(jìn)行全換液去除未貼壁的雜質(zhì)細(xì)胞，可見短梭形、星形細(xì)胞分散貼壁生長，以梭形細(xì)胞為主，胞質(zhì)豐富，胞核大、核仁清晰。培養(yǎng)至8 d細(xì)胞融合約90%，進(jìn)行傳代，消化傳代后，傳代細(xì)胞4 h完全貼壁生長，細(xì)胞形態(tài)均一呈梭形，細(xì)胞生長旺盛，3 d可進(jìn)行下一次傳代。細(xì)胞傳至第3代時(shí)，細(xì)胞聚集生長呈“魚尾紋”狀，見圖1。

圖1 倒置相差顯微鏡下第3代大鼠BMSCs ×200

2.2大鼠BMSCs的鑒定

2.2.1大鼠BMSCs的細(xì)胞表型(CD29、CD44)鑒定結(jié)果 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：培養(yǎng)的第3代大鼠BMSCs均一表達(dá)CD29、CD44，陽性率分別為99.44%、99.17%，見圖2。

2.2.2大鼠BMSCs的成脂誘導(dǎo)及油紅O染色 誘導(dǎo)后細(xì)胞大小未發(fā)生明顯變化，形態(tài)由原先的長梭條形變?yōu)椴灰?guī)則形，分散生長在培養(yǎng)瓶底。誘導(dǎo)2周后胞質(zhì)中出現(xiàn)大小不一的圓形脂滴，聚集分布在胞質(zhì)邊緣，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長逐漸增大增多，經(jīng)油紅O染色后成橘紅色，見圖3。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測CD29、CD44的表達(dá)

圖3 大鼠BMSCs成脂誘導(dǎo)后油紅O染色 ×200

2.3不同濃度BMP-7對大鼠BMSCs增殖的影響各組細(xì)胞接種后均出現(xiàn)短暫的停滯期，隨后細(xì)胞生長加速，增殖明顯，進(jìn)入細(xì)胞生長對數(shù)期，第5天后增殖速度明顯減慢，進(jìn)入平臺期。不同濃度BMP-7均對大鼠BMSCs增殖有促進(jìn)作用，見表1，同一時(shí)間點(diǎn)5組細(xì)胞進(jìn)行方差分析q檢驗(yàn)，結(jié)果表明75 ng/ml BMP-7促進(jìn)大鼠BMSCs增殖作用最顯著，采用75 ng/ml BMP-7進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4大鼠BMSCs誘導(dǎo)后形態(tài)學(xué)觀察① 陽性對照組:加入5 mmol/l β-巰基乙醇30 min后觀察到部分細(xì)胞胞體折光性增強(qiáng)，細(xì)胞形成突起，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長突起的數(shù)量逐漸增多且長度逐漸增長，誘導(dǎo)1 h后可見典型的神經(jīng)元樣細(xì)胞形態(tài)改變，2 h后神經(jīng)元樣細(xì)胞明顯增多，次級分支出現(xiàn)(圖4B)，6 h后神經(jīng)元樣細(xì)胞逐漸裂解、死亡。② BMP-7誘導(dǎo)組：與陽性對照組相比，含75 ng/mlBMP-7的誘導(dǎo)液加入后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化較陽性對照組出現(xiàn)早，細(xì)胞改變與陽性對照組相似，細(xì)胞突起較前者多，部分細(xì)胞突起與相鄰細(xì)胞的突起形成連接(圖4C紅色箭頭處可見)，由于2 h后神經(jīng)元樣細(xì)胞數(shù)量達(dá)到最多，故后續(xù)觀察及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測時(shí)間點(diǎn)均選用2 h。③ 陰性對照組絕大多數(shù)細(xì)胞無明顯形態(tài)學(xué)改變，未見較典型的神經(jīng)元樣細(xì)胞(圖4A)。

2.5各組細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后神經(jīng)元標(biāo)志物的表達(dá)情況陰性對照組不表達(dá)神經(jīng)絲蛋白NF-200及突觸素SYN-1，陽性對照組及BMP-7誘導(dǎo)組均有細(xì)胞表達(dá)NF-200及SYN-1，可見NF-200及SYN-1陽性細(xì)胞胞質(zhì)被染成亮棕黃色，NF-200及SYN-1陽性顆粒分布于胞體和軸突，見圖5。

3 討論

脊髓損傷的治療與修復(fù)是當(dāng)前世界性的醫(yī)學(xué)難題。脊髓損傷后局部神經(jīng)元細(xì)胞大量死亡，直接引起反射弧及神經(jīng)傳導(dǎo)的中斷，再加上局部炎性因子的升高及細(xì)胞死亡裂解后釋放的有毒物質(zhì)，形成了一系列不利于神經(jīng)細(xì)胞生存的內(nèi)環(huán)境。傳統(tǒng)的藥物+手術(shù)的治療方法只能減輕脊髓受損部位的水腫情況及恢復(fù)脊柱的穩(wěn)定性，而受損的神經(jīng)元由于其為永久性細(xì)胞則不能得到補(bǔ)充，在此種情景下快速直接地補(bǔ)充神經(jīng)元細(xì)胞或干細(xì)胞顯得尤為重要[5]。BMSCs來源廣、取材易、排斥小，目前研究[6]證實(shí)其具有跨胚層向神經(jīng)細(xì)胞分化的能力，故BMSCs是治療脊髓損傷理想的“種子細(xì)胞”。目前在體外誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化的方法主要有3種: 化學(xué)誘導(dǎo)、生長因子誘導(dǎo)和中藥成分誘導(dǎo)。化學(xué)誘導(dǎo)劑中以β-巰基乙醇應(yīng)用最為廣泛，Darabi et al[7]在研究中利用β-巰基乙醇誘導(dǎo)大鼠BMSCs，誘導(dǎo)得到的細(xì)胞形態(tài)上與神經(jīng)元細(xì)胞類似，且陽性表達(dá)神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)志物，因此本研究選取其為陽性對照。BMP-7是骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族重要的一員，目前研究[8]顯示骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族幾乎無所不能，其信號通路涉及細(xì)胞增殖與分化、胚胎發(fā)育、器官形成、組織修復(fù)與再生甚至癌癥的發(fā)生。BMP-7最早被發(fā)現(xiàn)具有成骨能力，近年來越來越多的研究揭示了BMP-7與神經(jīng)損傷修復(fù)關(guān)系密切，Luan et al[9]發(fā)現(xiàn)提高BMP-7的表達(dá)量可以減輕缺血缺氧對神經(jīng)系統(tǒng)造成的損傷，推斷BMP-7具有修復(fù)受損神經(jīng)系統(tǒng)作用。因此本研究推測BMP-7可以誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)元細(xì)胞分化，從而在脊髓損傷中起神經(jīng)保護(hù)作用。

表1 各時(shí)間點(diǎn)不同濃度BMP-7干預(yù)組在490 nm處吸光度值(n=5)

圖4 大鼠BMSCs誘導(dǎo)2 h形態(tài)學(xué)觀察 ×200A：陰性對照組；B：陽性對照組；C：BMP-7誘導(dǎo)組

圖5 各誘導(dǎo)組神經(jīng)元標(biāo)志物的表達(dá) ×200A：陰性對照組；B：陽性對照組；C：BMP-7誘導(dǎo)組；1：NF-200；2：SYN-1

本實(shí)驗(yàn)利用全骨髓貼壁法分離、培養(yǎng)大鼠BMSCs，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測第3代細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)，結(jié)果CD29、CD44陽性表達(dá)，表達(dá)率分別為99.44%、99.17%，提示所分離培養(yǎng)的細(xì)胞為純度較高的BMSCs。隨后對第3代大鼠BMSCs進(jìn)行成脂誘導(dǎo)，結(jié)果為陽性，證明所得到的BMSCs具有良好的分化能力。利用MTT法測定不同濃度的BMP-7對BMSCs增殖的影響，結(jié)果顯示BMP-7可以促進(jìn)大鼠BMSCs的增殖，抑制其凋亡，其中75 ng/ml BMP-7效果最為顯著。故本實(shí)驗(yàn)選取純度較高且分化能力良好的第3代大鼠BMSCs及75 ng/ml的BMP-7進(jìn)行下一步的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)研究。

本實(shí)驗(yàn)使用75 ng/ml的BMP-7對貼壁培養(yǎng)2 h的大鼠BMSCs進(jìn)行誘導(dǎo), 誘導(dǎo)2 h后大部分細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，形成軸突和樹突，細(xì)胞之間形成聯(lián)系，這些變化與陽性對照組相同，而陰性對照組無明顯變化。進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測神經(jīng)標(biāo)志物表達(dá)情況，結(jié)果顯示NF-200及SYN-1均為陽性，NF-200在神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)合成、儲存，是構(gòu)成神經(jīng)元胞體和神經(jīng)軸突細(xì)胞骨架的主要成分，在維持神經(jīng)元細(xì)胞獨(dú)特的形態(tài)特征、軸漿運(yùn)輸、大腦發(fā)育以及神經(jīng)元再生和可塑性方面發(fā)揮著重要作用[10-12]；SYN1 是分布于突觸前囊泡膜上的糖蛋白，參與神經(jīng)遞質(zhì)的釋放及突觸可塑性的調(diào)節(jié)，其表達(dá)量的高低反映了突觸的形成和密度[13-15]。本研究結(jié)果顯示, 誘導(dǎo)后2 h 的NF-200表達(dá)陽性, 表明BMP-7誘導(dǎo)大鼠BMSCs不僅形態(tài)上發(fā)生了變化，而且在分子水平上也發(fā)生了改變，陽性表達(dá)了神經(jīng)元細(xì)胞特異性標(biāo)志物，證明BMP-7成功誘導(dǎo)大鼠BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化；突觸素SYN1同樣陽性表達(dá)，表明誘導(dǎo)得到的神經(jīng)元樣細(xì)胞不僅在形態(tài)上及標(biāo)志物表達(dá)上與神經(jīng)元細(xì)胞接近，還有可能形成了完整的突觸，具有神經(jīng)元細(xì)胞的神經(jīng)傳遞功能。

近年來研究[15-17]表明BMP-2及BMP-4在BMSCs的神經(jīng)元細(xì)胞分化過程中起抑制作用，而同為骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族的BMP-7在本實(shí)驗(yàn)中證實(shí)其可以誘導(dǎo)大鼠BMSCs向神經(jīng)元細(xì)胞分化。目前BMP-2及BMP-4的生理作用及相關(guān)信號通路研究較多且取得了較多成果，而BMP-7的信號通路爭議點(diǎn)依然很多。本研究開創(chuàng)性的使用BMP-7誘導(dǎo)大鼠BMSCs向神經(jīng)元細(xì)胞分化，成功誘導(dǎo)了大鼠BMSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，為脊髓損傷的干細(xì)胞治療提供了新的思路，但誘導(dǎo)得到的神經(jīng)元樣細(xì)胞是否具有完整的神經(jīng)元細(xì)胞的神經(jīng)傳遞功能及其具體的誘導(dǎo)機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究。

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