姜黃素聯合干擾素-β/維甲酸對乳腺癌細胞的協同效應

葛素俠，任 敏，查曉軍，吳曉東

干擾素-β(interferon-β,IFN-β)聯合維甲酸(retinoic acid,RA)是目前已知的能夠抑制乳腺癌細胞生長的藥物，但目前乳腺癌細胞對于IFN-β/RA藥物的敏感性逐漸下降，抵抗性逐漸增強[1]。為解決這一問題筆者選擇IFN-β/RA與其他藥物聯合治療。姜黃素是從植物姜黃根莖中提取出來的一種多酚類化合物,許多研究[2]已證實姜黃素具有抗腫瘤活性，并被用于許多惡性腫瘤包括乳腺癌的治療。但目前關于姜黃素和IFN-β/RA聯合用藥在乳腺癌細胞中的研究鮮有文獻報道，因此該研究旨在探討兩者聯合用藥對乳腺癌細胞的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料人類乳腺癌細胞系(Michigan cancer foundation 7，MCF-7)購自中科院上海細胞生物學研究所細胞庫；IFN-β購自美國Millipore公司；RA、姜黃素、MTT 購自美國Sigma公司；膜聯素Ⅴ/碘化丙啶(Annexin V /propidium iodide， Annexin V/PI) 細胞凋亡試劑盒購自美國BioVision 公司；胎牛血清購自上海Excell公司；DMEM 培養基(高糖)購自美國Hyclone公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養 將人類乳腺癌MCF-7細胞用含有10%胎牛血清、1%雙抗(100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素)的DMEM培養基，置于37 ℃、5% CO2孵箱內培養，實驗取對數生長期細胞。

1.2.2MTT法檢測細胞活性 將細胞以104個/孔分別接種到96孔板中，每孔體積200 μl，置于37 ℃、5% CO2孵箱內培養。細胞貼壁后分別加入相應藥物，分組如下：對照組(加培養基)、姜黃素組(40 μmol/L)、IFN-β/RA組(IFN-β 750 U/ml，RA 1.5 μmol/L)、姜黃素聯合IFN-β/RA組(姜黃素40 μmol/L，IFN-β 375 U/ml，RA 0.75 μmol/L)。繼續孵箱內培養，分別在0、12、24、36、48 h五個時間點用MTT法測定細胞活性，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)10 μl，孵育4 h后終止培養，棄去孔內液體，每孔加入100 μl DMSO，搖床震蕩10 min，在酶聯免疫檢測儀上選擇490 nm波長處測定各孔的吸光度，繪制生長曲線。

1.2.3Annexin-V/PI 雙染流式細胞術檢測細胞凋亡 將收集的細胞懸液(細胞濃度為5×105個/ml)加入10 ml離心管中，加入100 μl Bingding Buffer和5 μl Annexin-V(20 μg/ml)，室溫避光30 min，再加入5 μl PI(50 μg/ml)，避光反應5 min后，加入400 μl Bingding Buffer，立即用FC500流式細胞儀分析。數據用細胞流式分析軟件(FCS Express4)分析。分別以Annexin V為橫坐標、PI為縱坐標作圖。結果分為以下幾類：左上象限代表壞死細胞，右上象限代表晚期凋亡細胞，左下象限代表正常細胞，右下象限代表早期凋亡細胞。其中早期凋亡細胞與晚期凋亡細胞的和代表細胞總凋亡的百分比。

2 結果

2.1姜黃素聯合IFN-β/RA顯著抑制MCF-7細胞活性MTT結果顯示，藥物作用48 h后，與對照組相比，姜黃素和IFN-β/RA單獨用藥時均能抑制細胞活性(F=9.33,P<0.05)；而與單藥組相比，姜黃素聯合IFN-β/RA組能顯著抑制細胞活性(F=6.81,P<0.05)。見圖1。

圖1 MTT法檢測姜黃素和IFN-β/RA單藥及聯合用藥對MCF-7細胞活性的影響與對照組比較：#P<0.05；與單藥組比較：*P<0.05

2.2姜黃素聯合IFN-β/RA能顯著促進MCF-7細胞凋亡結果顯示單藥組的細胞凋亡率高于對照組(F=191.83，P<0.05)；而聯合用藥組的細胞凋亡率明顯高于單藥組(F=44.02，P<0.05)。見圖2。

圖2流式細胞術檢測對MCF-7細胞凋亡的影響

A：Annexin V和PI染色結果；B：凋亡細胞百分比；

與對照組比較：#P<0.05；與單藥組比較：*P<0.05

3 討論

乳腺癌是全世界女性最常見的惡性腫瘤，是女性癌癥死亡的第二大常見原因[3]。在過去20年中，全球乳腺癌絕對數量上升了1.4倍，世界上大多數國家和地區乳腺癌的發病率上升了30%～40%[4]。在2015年，美國有231 840例被診斷為乳腺癌，其中40 290例患者死于乳腺癌，在我國，乳腺癌的發病率和死亡率呈持續上升趨勢，據國際癌癥研究所預計，在2030年我國女性乳腺癌發病數可達到23.4萬例，因乳腺癌死亡7.0萬例[5]。除了手術和放療外，化學藥物仍是乳腺癌治療的重要手段。但目前單一的藥物總有這樣或那樣的缺點，嚴重影響了藥物的療效，降低患者的生存質量，因此尋求有效的聯合用藥以減少藥物的毒副作用至關重要。

IFN-β屬于I型干擾素，是一種由成纖維細胞產生的細胞因子，具有抗病毒、抑制和殺傷腫瘤細胞、抑制細胞生長、免疫調節等多種生物學功能，目前已成功用于治療惡性腫瘤、病毒性感染和多發性硬化癥。IFN-β是第一個在臨床上用于惡性腫瘤治療的細胞因子，在目前的許多動物模型和臨床研究[6]中，都顯示IFN-β能夠明顯的抑制腫瘤細胞的生長，如乳腺癌細胞、卵巢癌細胞、黑色素瘤細胞。IFN-β的抗腫瘤機制主要有：增加腫瘤特異性抗原的表達量，提高自然殺傷細胞的殺傷水平；在淋巴瘤細胞系中下調c-Myc的表達，抑制腫瘤細胞增殖[7]。盡管單藥IFN-β對白血病具有很好的治療效果，但對于一些實體腫瘤單藥IFN-β治療效果卻不十分理想。

RA是維生素A在體內代謝的活性產物或衍生物，在胚胎發育、 器官形成、 細胞增殖和分化等許多基本生命活動中發揮著重要作用。RA可與細胞核內的相應受體結合，進而結合在靶基因的特定區域，調控目的基因表達，從而抑制細胞增殖，誘導細胞分化、凋亡，發揮生物學效應[8]。RA是臨床上常用的誘導分化劑，是目前臨床上用于治療急性早幼粒細胞性白血病的首選藥物。此外,RA也已成功用于乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌等實體腫瘤的臨床治療。

為了解決IFN-β在臨床上對多數實體腫瘤治療效果差這一問題，研究者們提出了許多新的治療方法，在這些方法中，IFN-β與RA的聯合用藥取得了很好的效果，大大提高了單藥IFN-β對實體腫瘤的治療效果[9]。目前有許多研究[10]表明IFN-β與RA聯合用藥(IFN-β/RA)比單藥能更有效地抑制細胞生長，而且這種協同抗腫瘤效應在人類乳腺癌細胞及乳腺癌裸鼠移植瘤中也得到了證實。但隨著乳腺癌發病率的提高以及年輕化，乳腺癌對于IFN-β/RA也逐漸出現了“耐藥現象”，抵抗性逐漸增強，敏感性逐漸下降，治療效果越來越不理想，因此積極尋求新的治療方案以提高乳腺癌患者的生存率及生存質量就顯得十分迫切。

姜黃素是從天然植物姜黃中提取出來的一種色素，自古以來就被用作藥物。其具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等廣譜的生物學作用，且來源廣泛，價格低廉，毒副作用小，對正常細胞幾乎無影響，因此具有十分廣泛的應用前景[11]。近年來，由于惡性腫瘤如肺癌、胃癌、乳腺癌等疾病的發病率在逐年上升，嚴重威脅了人類的健康，因此姜黃素的抗腫瘤作用被越來越多的研究者們重視，相關研究[12-15]表明姜黃素對肺癌、胃癌、骨肉瘤、胰腺癌等許多惡性腫瘤都具有明顯的抗腫瘤作用。姜黃素的抗腫瘤機制較為復雜，在不同的腫瘤細胞中表現出不同的效應，目前認為姜黃素的抗腫瘤機制主要有：抑制某些癌基因表達，促進抑癌基因表達；抑制腫瘤細胞的增殖，誘導腫瘤細胞的凋亡；抑制腫瘤血管的生成等[13-14,16]。

本研究結果表明，相對于姜黃素和IFN-β/RA單一藥物治療，姜黃素和IFN-β/RA的聯合用藥能更明顯地抑制MCF-7細胞活性，且促進細胞凋亡。而且，在姜黃素與IFN-β/RA聯合用藥時，IFN-β/RA的藥物濃度比單獨用IFN-β/RA時藥量減少，從而減少IFN-β/RA高濃度時的毒副作用。綜上所述，姜黃素能協同性地增強IFN-β/RA對人類乳腺癌MCF-7細胞的抗腫瘤作用，抑制腫瘤細胞增殖，促進細胞凋亡。這種協同效應可以在提高IFN-β/RA藥物療效的情況下減少其藥物用量，增強藥物敏感性，降低抵抗性，從而控制單一藥物的副作用，達到更好的治療效果，為乳腺癌的臨床治療提供一種新的選擇。

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