ADAMDEC1對人腦膠質瘤U87細胞生物學行為的影響

黃 浩，鄭曉梅，劉學良，徐 斌，張 燁，何濟民，江 涌 ，陳禮剛，劉 亮

膠質瘤是發生于神經外胚層的腫瘤，占顱內腫瘤的35%～60%，是威脅人類健康的主要惡性腫瘤之一[1]。目前治療方法以手術治療為主，輔以放化療，但手術切除腫瘤后并發癥多且重，并且血腦屏障的存在阻止了絕大多數化療藥物進入腦組織，在顱內難以達到有效藥物濃度，且常見化療藥物毒性太大，難以達到既消滅膠質瘤又不損傷正常組織的效果，故患者平均生存期通常較短[2]。因此，探索膠質瘤新的有效治療手段對提高膠質瘤患者的生存質量有重要實際意義。該研究通過體外培養惡性膠質瘤細胞U87MG，并抑制解聚素金屬蛋白酶家族癸蛋白1(ADAMDEC1)的表達，探究ADAMDEC1對U87細胞增殖、侵襲、遷移、黏附和凋亡等生物學行為的影響，以期為腦膠質瘤的治療提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1細胞及主要試劑人腦膠質瘤U87細胞株購自中國科學院上海細胞庫，攜帶下調ADAMDEC1表達的特異性siRNA(ADAMDEC1-RNAi)的慢病毒及其陰性對照(CONTROL-RNAi)慢病毒購自上海吉凱基因化學技術有限公司。ADAMDEC1-RNAi序列如下：TCCCAGGAATCTTGTGAATTT；CONTROL-RNAi序列如下：TTCTCCGAACGTGTCACGT。新生胎牛血清(FBS)購自杭州四季青生物技術公司；細胞培養液高糖型DMEM購自美國Hyclone公司；Metrigel、流式細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；CCK-8試劑購自上海東仁化學科技有限公司；總RNA抽提試劑盒購自上海普飛公司；cDNA反轉錄試劑盒(M-MLV)購自美國Promega公司；Real-time PCR試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司；ADAMDEC1一抗(小鼠)購自英國Abcam公司；GAPDH一抗(兔)購自英國CST公司；二抗(羊抗鼠、羊抗兔)均購自BIOSWAMP公司；Transwell小室購自美國Corning公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養及轉染 人腦膠質瘤U87細胞株接種在含10% FBS的高糖型DMEM培養液(完全培養基)中，置于37 ℃、5%CO2的培養箱中常規培養，隔2～3 d更換培養基，3～5 d細胞傳代。處于增殖期的U87細胞，胰蛋白酶消化后接種于6孔板中繼續培養，當細胞密度達20%～30%時換液，加入完全培養基1 ml，加入用Enhanced Infection Solution稀釋成1×108TU/ ml的病毒液40 μl，確保復感染指數(multiplicity of infection, MOI)值為20，再加入5 μg Polybrene，輕微晃動混勻后，置于培養箱中培養16 h后再次換液，加入完全培養基2 ml，繼續培養56 h。

1.2.2ADAMDEC1 mRNA表達水平的檢測 收集穩定轉染的人腦膠質瘤U87細胞，TRIzol裂解后，抽提總RNA樣品、反轉錄獲得cDNA等操作方法均嚴格遵照試劑盒說明書進行，后用Real-time PCR(兩步法)檢測ADAMDEC1基因mRNA的表達情況，其上游引物序列為：AGATCCACGACCATGCTCAG；其下游引物序列為：GCCTCAATAACAGCAACCGA；GAPDH上游引物序列為：TGACTTCAACAGCGACACCCA；下游引物序列為：CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA。通過計算2-ΔΔCt來檢測ADAMDEC1基因的相對表達水平。

1.2.3ADAMDEC1蛋白表達水平的檢測 收集穩定轉染的人腦膠質瘤U87細胞，4 ℃裂解細胞，95 ℃以上加熱10 min，11 000 r/min離心10 min，取上清液-20 ℃凍存。制膠，上樣蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳(80 V 40 min、120 V 50 min)，轉膜(90 V 45 min)，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，ADAMDEC1鼠抗人一抗單克隆抗體(1 ∶1 000)4 ℃振蕩孵育過夜，羊抗鼠二抗(1 ∶10 000)室溫下孵育2 h，曝光成像，應用軟件Quantity-one分析灰度值。同時測定內參GAPDH的表達。

1.2.4CCK-8法檢測細胞增殖 制備未轉染U87細胞懸液，以每孔100 μl含4×103個細胞接種于96孔板，待細胞貼壁后，按1.2.1中細胞轉染方法轉染細胞，16 h后更換為普通完全培養基。于16、24、36、48、60、72 h分別更換為普通完全培養基，每孔加入10 μl CCK-8試劑，培養箱中孵育1 h，用分光光度計測定450 nm波長處各孔吸光度(OD值)。實驗重復3次。

1.2.5CCK-8法檢測細胞黏附 本實驗Metrigel基質膠用無血清高糖型DMEM培養基進行稀釋，稀釋比例為1 ∶8，稀釋后加入96孔板(100 μl/孔)包被基底膜，封口膜密閉后超凈工作臺中過夜，過夜后吸出孔板內多余的液體，每孔加入50 μl無血清冷DMEM，培養箱內孵育30 min，使基底膜充分水化。穩定轉染后的細胞以胰蛋白酶消化，計數并調整細胞濃度，以每孔100 μl含4×103個細胞接種到前述制備好的96孔板中，培養箱中培育3 h，棄去培養基，PBS沖洗2遍，每孔加入90 μl培養基及10 μl CCK-8試劑，繼續培養2 h，用分光光度計測定450 nm波長處各孔吸光度(OD值)。實驗重復3次。

1.2.6Transwell體外侵襲實驗 本實驗Metrigel基質膠用無血清高糖型DMEM培養基進行稀釋，稀釋比例為1 ∶5，取50 μl均勻涂于上室細胞生長表面，37 ℃孵育2 h，吸出上室內多余的液體，加入50 μl無血清DMEM，培養箱內孵育30 min，使基底膜充分水化。胰蛋白酶消化穩定轉染的細胞，收集制備細胞懸液，離心后棄去上層培養液，PBS液洗滌2次，無血清DMEM重懸細胞，計數并調整細胞濃度，以每孔100 μl含1×104個細胞加入上室內，下室加入500 μl含15% FBS的新配制的完全培養基。培養箱中培育36 h，取出上室，濕棉簽輕輕擦凈上室內面Metrigel基質膠及未穿過基底膜的細胞，將上室置于4%多聚甲醛溶液中固定15 min，后再用0.1%結晶紫溶液室溫下染色15 min，PBS液清洗3次。Transwell小室輕置于載玻片上，顯微鏡下觀察拍照，隨機選取10個200×視野進行細胞計數。實驗重復3次。

1.2.7Transwell體外遷移實驗 胰蛋白酶消化穩定轉染的細胞，收集制備細胞懸液，離心后棄去上層培養液，PBS液洗滌2次，無血清DMEM重懸細胞，計數并調整細胞濃度，以每孔 100 μl含1×104個細胞加入Transwell上室，下室加入500 μl含15% FBS的新配制的完全培養基。培養箱中培育12 h，取出上室，濕棉簽輕輕擦凈上室內面未穿過基底膜的細胞，染色、拍照方法同侵襲實驗。實驗重復3次。

1.2.8流式細胞術檢測細胞凋亡 用不含EDTA的胰蛋白酶消化處于對數生長周期的穩定轉染的細胞，無菌膠頭滴管輕輕吹打，盡可能使其分散為單個細胞，1000 r/min離心5 min后棄去上層培養基，PBS液洗滌2次，遵照流式細胞凋亡檢測試劑盒說明書添加試劑制備樣品，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

2 結果

2.1細胞轉染效率ADAMDEC1-RNAi及其陰性對照CONTROL-RNAi分別轉染U87細胞，轉染72 h后觀察GFP表達情況，熒光率達95%以上，見圖1。

圖1 U87細胞的轉染效率 ×100A：明視野；B：綠色熒光視野

2.2ADAMDEC1基因沉默情況ADAMDEC1-RNAi轉染U87細胞后，其細胞內ADAMDEC1 mRNA表達量較其對照CONTROL-RNAi轉染U87細胞后明顯降低(t=14.611，P<0.01)，見圖2。

2.3ADAMDEC1蛋白沉默情況ADAMDEC1-RNAi轉染U87細胞后，其細胞內ADAMDEC1蛋白表達量較其對照CONTROL-RNAi轉染U87細胞后明顯降低(t=12.517，P<0.01)，見圖3。

2.4ADAMDEC1基因沉默表達對U87細胞增殖能力的影響CCK-8法檢測結果顯示：ADAMDEC1-RNAi組細胞的增殖抑制在轉染的第16 h后開始出現，較CONTROL-RNAi組差異有統計學意義(t=7.478、7.753、8.862、5.592、9.002，P<0.05)，見圖4。

圖2 Real-time PCR檢測轉染后U87細胞ADAMDEC1 mRNA的表達變化與CONTROL-RNAi組比較：**P<0.01

圖3 Western blot檢測轉染后U87細胞ADAMDEC1蛋白的表達變化與CONTROL-RNAi組比較：**P<0.01

圖4 CCK-8法檢測ADAMDEC1-RNAi轉染后U87細胞的增殖變化與CONTROL-RNAi組比較：*P<0.05

2.5ADAMDEC1基因沉默表達對U87細胞黏附能力的影響CCK-8法檢測結果顯示：ADAMDEC1-RNAi組細胞的黏附能力較CONTROL-RNAi組差，差異有統計學意義(t=12.697，P=0.006)，見圖5。

圖5 CCK-8法檢測ADAMDEC1-RNAi轉染后U87細胞的黏附能力變化與CONTROL-RNAi組比較：**P<0.01

2.6ADAMDEC1基因沉默表達對U87細胞體外侵襲能力的影響實驗采用Matrigel包被Transwell上室基底膜，通過檢測穿過基底膜的U87細胞數量來證明侵襲能力的變化。結果顯示：ADAMDEC1-RNAi轉染細胞后，細胞水解Matrigel穿過基底膜的數量較CONTROL-RNAi轉染組明顯減少，差異有統計學意義(t=5.263，P=0.001)，見圖6、7。

圖6 穿過Transwell上室基底膜到達下室的細胞結晶紫染色×100A：ADAMDEC1-RNAi；B：CONTROL-RNAi

2.7ADAMDEC1基因沉默表達對U87細胞體外遷移能力的影響實驗采用Transwell小室檢測U87細胞的遷移能力。結果顯示：ADAMDEC1-RNAi轉染細胞后，細胞穿過小室基底膜的數量較CONTROL-RNAi轉染組明顯減少，差異有統計學意義(t=9.189，P<0.01)，見圖8、9。

2.8ADAMDEC1基因沉默表達對U87細胞凋亡的影響細胞轉染后，流式細胞術檢測結果顯示：ADAMDEC1-RNAi轉染組的細胞凋亡率較CONTROL-RNAi轉染組明顯增高，差異有統計學意義(t=43.737，P=0.001)，見圖10、11。

圖7 ADAMDEC1-RNAi轉染后U87細胞的侵襲能力受到抑制與CONTROL-RNAi組比較：**P<0.01

圖8 穿過Transwell上室基底膜到達下室的細胞 結晶紫染色 ×100A：ADAMDEC1-RNAi；B：CONTROL-RNAi

圖9 ADAMDEC1-RNAi轉染后U87細胞的遷移能力受到抑制與CONTROL-RNAi組比較：**P<0.01

圖10 轉染后U87細胞的凋亡情況(UR+LR)A：ADAMDEC1-RNAi；B：CONTROL-RNAi

圖11 ADAMDEC1-RNAi轉染后U87細胞的凋亡增加與CONTROL-RNAi組比較：**P<0.01

3 討論

神經膠質瘤大多數起源于不同類型的神經膠質，WHO中樞神經系統腫瘤分類根據腫瘤的惡性形態學特征(細胞性質、核分裂、核異型、微血管增殖和壞死等)分為四級，其中三級、四級為高度惡性腫瘤，即便使用手術、放射治療及化學藥物治療的綜合治療措施，目前仍無法治愈該疾病。因此，有必要進一步探索影響膠質瘤細胞生物學行為的新因素及其可能的作用機制。

惡性腫瘤侵襲、遷移是對生命最具威脅的因素。去整合素—金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase，ADAM)家族含有金屬蛋白酶和去整合素功能結構域，ADAM可通過去整合素結構域結合整合素，從而能參與細胞—細胞的粘連作用，可降解細胞外基質(ECM)，直接黏附ECM并參與調節細胞內外信號通路，降解ECM及基膜，影響細胞與基底膜的相互作用，可對細胞的分化、極性、遷移、增殖等進行調節，降低細胞的凋亡比率[3]。

目前已有研究[4]表明在多種不同類型的惡性腫瘤中，某些ADAM 家族成員表達量增多，如：正常細胞中ADAM 17表達量很少，但在肝癌、胃癌、食管鱗癌、卵巢癌、前列腺癌等人類多種常見惡性腫瘤中表達量明顯增高[5-7]。此外， ADAM17的表達量與膠質瘤的惡性程度呈正相關已被研究[8]所證實。ADAMDEC1(ADAM-like，Decysin 1)屬于ADAM的另一成員，研究[9]顯示人的ADAMDEC1 基因位于 8p12 染色體上，ADAMDEC1具有整聯蛋白、金屬內肽酶結合的活性，調控細胞附著，整聯蛋白介導信號轉導途徑，參與蛋白水解。同時促進細胞膜中的多種蛋白及細胞外基質、基膜降解，破壞阻止腫瘤細胞侵襲的組織學屏障，對惡性腫瘤的侵襲、遷移等生物學行為起重要的作用[10]。從而可推測ADAMDEC1 基因可能參與了體內腫瘤的侵襲和轉移等過程，并有可能成為監測疾病活動的指標，甚至是靶向治療的靶點。相關研究[11]顯示，ADAMDEC1基因在顱咽管瘤中處于高表達狀態，且在釉質上皮型及復發的顱咽管瘤中尤其明顯，其在腫瘤的發生和發展過程中發揮著重要而復雜的作用。課題組前期研究[12]已經證明ADAMDEC1在高級別膠質瘤中高度表達，對膠質瘤患者術后進行隨訪，提示膠質瘤組織中ADAMDEC1含量高的膠質瘤惡性程度高，同時患者預后差。說明ADAMDEC1與膠質瘤的惡性程度密切相關。

為進一步探討ADAMDEC1在膠質瘤發生、進展中的作用，本研究采用慢病毒轉染技術特異性抑制U87細胞中ADAMDEC1基因的表達。實驗組與對照組進行對比，CCK-8檢測提示下調ADAMDEC1表達能夠顯著抑制U87細胞的增殖和黏附能力；Transwell檢測提示下調ADAMDEC1表達能夠顯著抑制U87細胞的侵襲和遷移能力；流式細胞技術檢測提示下調ADAMDEC1表達能夠促進U87細胞的凋亡。

綜上所述，體外細胞實驗顯示ADAMDEC1蛋白與U87細胞的惡性生物學行為密切相關。即ADAMDEC1通過促進U87細胞的增殖、黏附、侵襲和遷移能力，抑制U87細胞的凋亡而實現對腫瘤發生、發展的調控，但具體作用機制尚待進一步研究明確，因此ADAMDEC1有望成為膠質瘤基因治療的潛在靶位。

[1] Jovcevska I, Kocevar N, Komel R.Glioma and glioblastoma-how much do we (not) know?[J].Mol Clin Oncol,2013,1(6): 935-41.

[2] Nobusawa S, Hirato J, Yokoo H. Molecular genetics of ependymomas and pediatric diffuse gliomas:a short review[J]. Brain Tumor Pathol, 2014,31(4): 229-33.

[3] Walker J L,Fournier A K,Assoian R K. Regulation of growth factor signaling and cell cycle progression by cell adhesion and adhesion dependent changes in cellular tension[J].Cytokine Growth Factor Rev,2005,16(5): 395-405.

[4] Wu K, Liao M, Liu B, et al. ADAM-17 over-expression in gallbladder carcinoma correlates with poor prognosis of patients[J].Med Oncol,2011,28(2): 475-80.

[5] Gao M Q, Kim B G, Kang S, et al. Human breast cancer-associated fibroblasts enhance cancer cell proliferation through increased TGF-α cleavage by ADAM17[J].Cancer Lett, 2013,336(1): 240-6.

[6] Ni S S, Zhang J, Zhao W L, et al. ADAM17 is overexpressed in non-small cell lung cancer and its expression correlates with poor patient survival[J].Tumour Biol,2013,34(3): 1813-8.

[7] Shou Z X, Jin X, Zhao Z S. Upregulated expression of ADAM17 is a prognostic marker for patients with gastric cancer[J]. Ann Surg,2012,256(6): 1014-22.

[8] Wu B, Sha L, Wang Y, et al. Diagnostic and prognostic value of adisintegrin and metalloproteinase-17 in patients with gliomas[J].Oncol Lett ,2014,8(6): 2616-20.

[9] Crouser E D, Culver D A, Knox K S, et al.Gene expression profiling identifies MMP-12 and ADAMDEC1 as potential pathogenic mediators of pulmonary sarcoidosis[J].Am J Respir Crit Care Med,2009,179(10): 929-38.

[10] Lund J, Olsen O H, S?rensen E S, et al. ADAMDEC1 is a metzincin metalloprotease with dampened proteolytic activity[J].J Biol Chem,2013,288(29): 21367-75.

[11] Xu J, Liu L, Zheng X, et al. Expression and inhibition of ADAMDEC1 in craniopharyngioma cells[J]. Neurol Res, 2012,34(7): 701-6.

[12] 劉學良,鄭曉梅,李學涵,等.ADAMDEC1蛋白在膠質瘤中的表達及其意義[J].西安交通大學學報(醫學版),2017,38(4):569-73.