甲狀腺功能減退癥對成年期SD大鼠腎臟超微結構的影響及L-T4替代治療的效果

劉 翔,王 芬,桂 麗,朱德發

甲狀腺功能減退癥(簡稱甲減)是由于各種原因引起的甲狀腺激素(tyroxine hormones, TH)合成、分泌或生物效應不足引起的全身性疾病。TH與腎臟疾病關系密切，在腎臟發育、維持水電解質平衡、腎功能等方面具有重要作用。先天性甲減患者腎臟質量較小，腎缺如、異位、多囊腎等腎臟發育異常發病率増高[1]。臨床研究[2]表明成年期甲減可導致腎功能損傷,其發生的具體機制尚不清楚。因此，該研究采用丙基硫氧嘧啶(propylthiouracil，PTU)飲水制備甲減大鼠模型，以觀察甲減對成年期SD大鼠腎臟超微結構的影響以及左旋甲狀腺素(levothyroxine,L-T4)替代治療的效果，為進一步探討甲減對腎臟影響的發生機制提供形態學方面的依據。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器PTU(上海復星朝輝藥廠)，規格：50 mg×100片/盒；L-T4(德國默克公司)；三碘甲狀腺原氨酸(triiodothyronine，T3)、甲狀腺素(thyroxine，T4)、促甲狀腺素(thyroid stimulating hormone，TSH)放射免疫試劑盒(北方生物技術研究所)。 JEM-1230型透射電鏡(日本電子株式會社)。

1.2動物模型制備本實驗選用的研究對象為3月齡健康成年雄性SD大鼠，共30只，造模前體質量在260～290 g，均從安徽醫科大學實驗動物中心購買。30只大鼠常規進行分籠喂養，每籠5只大鼠，使用標準飼料，采取自由飲水，維持室溫21～26 ℃，室內濕度控制在(50±5)%。經過1周適應性喂養后，將30只大鼠隨機分為3組，每組10只，分別為對照組、甲減組和L-T4治療組。用PTU飲水法(配成濃度0.05%)建立甲減大鼠模型[3]。自第5周起，L-T4治療組大鼠在繼續PTU飲水的同時，每天根據體質量，按6 μg/100 g計算劑量給予L-T4腹腔注射，共持續2周；同時對照組及甲減組大鼠予每日腹腔注射同等劑量的生理鹽水。給藥劑量根據每周各組大鼠稱量的體質量結果給予調整。

1.3標本制備造模完成后稱量所有大鼠的體質量，之后進行腹主動脈取血，取血前使用水合氯醛充分麻醉(按0.3 ml/100 g體質量計算劑量進行腹腔注射)，之后打開腹腔，在腹主動脈進行最大程度的取血，取血后迅速離心(4 000 r/min×15 min)，取上層血清待查。取血后將腎臟迅速分離，將腎臟標本放在4%多聚甲醛溶液中，等待進一步處理后使用透射電鏡觀察。

1.4甲狀腺功能測定使用放射免疫法測定各組大鼠的血清T3、T4及TSH水平，評估甲狀腺功能。

1.5透射電鏡觀察將分離出的腎臟標本切成約1 mm3小塊，放入4 ℃的2.5%戊二醛中固定4～6 h，包埋前經0.1 mol/L PBS充分沖洗，再以l%鋨酸固定1 h后，經乙醇梯度脫水，環氧樹脂(Epon812)包埋，再使用LKB-NOVA型超薄切片儀修塊，并進行超薄切片(片厚70 nm)。將切片放在醋酸鈾及枸櫞酸鉛溶液中浸泡染色，之后常規沖洗，用日產JEM-1230型透射電鏡對腎臟超微結構進行觀察并射片保存。

2 結果

2.1各組大鼠體質量比較造模前，三組大鼠體質量水平差異無統計學意義；造模結束后，對照組、甲減組、L-T4治療組體質量分別為(420.12 ± 50.06)、(343.06± 36.07)、(384.19±30.32)g，三組大鼠體質量各增加了48.14%、22.18%、34.90%；造模后三組間體質量比較顯示：甲減組、L-T4治療組體質量顯著低于對照組(P<0.05)。

2.2各組大鼠血清T3、T4及TSH水平與對照組相比，甲減組大鼠血清T3、T4水平顯著降低，TSH水平顯著升高(P<0.01)；L-T4治療組大鼠血清TH及TSH水平與對照組比較差異無統計學意義。見表1。

2.3各組大鼠腎臟超微結構在放大10 000倍的透射電鏡下觀察：對照組大鼠腎小球細胞結構完整，線粒體發達、內部嵴結構清晰。甲減組大鼠腎小球基底膜結構不規則；細胞器結構模糊不清，線粒體明顯空泡變性，內部嵴斷裂消失，粗面內質網有脫顆粒現象，間質水腫。L-T4治療組與以上超微結構改變明顯改善。見圖1。

在放大20 000倍的透射電鏡下觀察：對照組大鼠腎小球足細胞結構完整，足突排列清晰，足細胞內線粒體內部嵴結構清晰。甲減組大鼠腎小球基底膜形態不規則；內皮細胞內線粒體空泡變性；足細胞明顯腫脹、融合，內部細胞器結構不清晰；間質水腫。L-T4治療組與以上超微結構改變明顯改善。見圖2。

表1 各組大鼠血清 T3、T4、TSH水平(n=10，±s)

與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖1 電鏡下大鼠腎小球結構圖 ×10 000A：對照組；B：甲減組；C：L-T4治療組

圖2 電鏡下腎小球足細胞結構圖 ×20 000A：對照組；B：甲減組；C：L-T4治療組

3 討論

采用PTU飲水制備大鼠甲減模型已被廣泛應用。實驗中觀察大鼠的活動、飲水及毛發等情況，本實驗中觀察到在給予PTU(0.05%)飲水約3周時，實驗大鼠即開始出現活動減少，對外界環境的刺激反映淡漠，飲食飲水減少，部分大鼠后頸部毛發稀疏脫落等類似于甲減的臨床表現。6周造模結束后，甲狀腺功能測定結果顯示，甲減組甲狀腺激素水平較對照組顯著降低，TSH較對照組顯著增高，L-T4替代治療組血清甲狀腺激素及TSH水平與對照組差異無統計學意義，表明造模成功。

在本研究中，采用透射電鏡觀察發現成年期TH缺乏導致大鼠腎臟超微結構發生了一系列明顯的病理改變。具體表現為甲減組大鼠腎小球足細胞明顯腫脹、融合，基底膜結構不規則，內部細胞器結構不清晰，線粒體明顯空泡變性，內部嵴斷裂消失，粗面內質網有脫顆?，F象，間質水腫。目前對甲減大鼠腎臟結構方面的研究尚不多，有采用光鏡對甲減大鼠腎臟結構的研究[4]顯示，甲減大鼠的腎小管間質結締組織、炎性細胞增多，近端腎小管細胞胞質自溶，血管球收縮，且隨病程進展腎臟損傷呈加重趨勢。本實驗從微觀角度進一步證實甲減對腎臟形態結構有損傷作用。

足細胞與腎小球濾過功能密切相關，研究[5]顯示許多動物模型的腎小球疾病中有足細胞的損傷。目前的一些研究[6]表明多種因素會引起足細胞功能異常、細胞凋亡以及數目減少等，包括了血流動力學異常、高脂、高糖以及尿蛋白負荷過重等。國內王瑞英 等[7]研究表明甲減時足細胞損害的標志蛋白Desmin表達顯著增高，且隨著甲減病程的進展該蛋白表達呈遞增趨勢。線粒體是體內細胞進行有氧氧化的主要結構，提供了細胞生命活動所需能量的80%，其數量分布、形態結構及代謝反應受環境影響變化明顯，因此是細胞病變或損傷最敏感的指標之一。本實驗中透射電鏡下甲減大鼠足細胞內的線粒體出現腫脹、空泡變性，雙層膜結構不清，內部嵴斷裂、消失等變化。推測其可能的機制為：TH是調節能量代謝的重要激素，在TH缺乏時，能量代謝發生了紊亂，致使組織細胞內有氧氧化和氧化磷酸化偶聯作用障礙，故而與能量代謝密切相關的線粒體出現較為顯著的形態結構改變。同時本研究觀察到甲減組大鼠腎臟足細胞內的粗面內質網發生了擴張、斷裂,結構零亂松散以及核糖體脫顆粒等病理改變，粗面內質網是合成蛋白質的場所。已有研究[8]顯示各種因素如缺氧、毒物作用和感染等均會導致其病理變化。甲減時腎臟以上超微結構的改變均可能影響其正常功能的發揮。現有研究[9]證實甲減的早期即有腎小球濾過率的下降,腎小管重吸收及最大分泌能力改變,以及尿量減少等，長期甲減造成的改變更為明顯,隨著腎臟損害的加重，出現血尿素氮、肌酐的升高。

L-T4替代治療是甲減的標準治療方法，本研究中顯示L-T4替代治療后隨著甲狀腺功能的恢復，在電鏡下觀察到大鼠腎臟受損的超微結構明顯改善。王瑞英 等[4]觀察甲減對腎臟的影響以及激素恢復快慢對腎臟病理的影響，發現了激素的快速恢復更有利于腎臟的病理恢復。Mooraki et al[10]對4例由甲減所致的急性腎衰竭患者L-T4治療前后的血肌酐和肌酐清除率的測定發現，經過L-T4治療6～12周時，血肌酐明顯下降，而肌酐清除率明顯上升。以上研究說明TH可能會直接參與腎臟結構和功能的調節。

本研究中在造模結束時對所有大鼠進行稱重，顯示甲減組的體質量增長水平遠低于對照組，這與之前對甲減鼠的大多數報道相一致[11-13]。然而，一些臨床研究[14]報道甲減患者體質量增加。眾所周知，TH可提高大多數組織的耗氧率，增加產熱效應，因此，甲減可能導致機體代謝率和能量消耗降低。然而，研究[15]表明，甲減患者的體質量增加可能主要是由于水潴留增加有關，而非由能量消耗減少導致肥胖的后果。在本研究中觀察到甲減大鼠腎臟超微結構表現為明顯的間質水腫，提示甲減大鼠機體可能存在水潴留，然而并未顯示甲減大鼠體質量增加，因此，甲減大鼠體質量增加減少可能主要與攝入減少有關，超過了甲減導致的能量消耗的減少[16]。另外，本研究中3月齡SD大鼠的中樞神經系統發育已相當于人類成年期水平，但其身體發育尚處于成年早期階段，因此，TH的缺乏對生長發育尤其是體質量增長有較大的影響。經L-T4替代治療2周后，大鼠的體質量增長情況較前有所改善，但較對照組仍偏低，可能與L-T4治療時間偏短有關。

綜上所述，甲減可引起成年期SD大鼠腎臟超微結構出現一系列形態學改變，經過L-T4治療后上述損害可以部分恢復，說明甲減導致的腎臟超微結構損害是部分可逆的，為進一步探討甲減對腎臟影響的發生機制提供形態學方面的依據。

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