早期區域動脈灌注微量低分子肝素改善高脂血癥性急性胰腺炎微循環的實驗研究

呂賀賀，項和平，王 偉，李 賀，高 明

近年來，隨著人民生活水平的不斷提高，人們的飲食結構及生活方式也發生了很大的變化，高脂血癥、肥胖、糖尿病的發病率呈逐年上升趨勢，其中由高脂血癥導致的高脂血癥性急性胰腺炎(hyperlipidemic acute pancreatitis， HLAP)的發病率也越來越高。臨床研究[1]表明高脂血癥性急性胰腺炎的發病率約占據了全部急性胰腺炎總數的1.3%～3.8%。HLAP并發癥多、進展迅速、易反復發作、重癥化率及死亡率高,其診治具有自身特點[2-3]。但其發病機制仍不是十分明確，目前臨床治療效果差強人意，因此積極尋求快速有效的治療HLAP的治療方案已迫在眉睫。本課題組在前期的研究中發現高脂血癥性胰腺炎中胰腺微循環功能障礙與病情惡化具有相關性，推斷胰腺微循環障礙可能是高脂血癥性胰腺炎病情加重的重要環節之一。該文擬探討區域動脈灌注微量低分子肝素(low molecular weight heparin，LMWH)對HLAP微循環變化的影響，從而更好地為臨床治療提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物及分組 健康成年雄性倉鼠共60只，清潔級，30～45 g，飼養在標準實驗室條件下，在整個實驗過程中保持飼養環境的晝夜節律。所有倉鼠自由進水，室內光照遵循12 h明暗周期(7：30 am開燈)，溫度恒定于23～25 ℃，濕度為(55±5)%。均使用相同的高脂飼料(20%豬油+10%膽固醇+1%甲基硫氧嘧啶+1%膽酸鈉+68.9%普通飼料)在同等條件下喂養，飼養4周后取所有動物靜脈血檢測三酰甘油水平，并予以實驗動物行肝膽胰B超檢查，隨機抽出30只三酰甘油水平升高3倍以上且肝膽胰無病變者作為最終實驗對象。30只倉鼠隨機均分為3組：區域動脈輸注生理鹽水組(LAI+saline組)、區域動脈輸注低分子肝素組(LAI+LMWH組)、靜脈輸注低分子肝素組(IV+LMWH組)。剩余倉鼠作為供體，為試驗倉鼠供血。所有倉鼠每周進行稱重，并由專人觀察體質量變化情況。

1.1.2各組造模及給藥 ① LAI+saline組：造模成功后關腹，30 min后經腹主動脈灌注生理鹽水；② LAI+LMWH組：造模成功后關腹，30 min后經腹主動脈灌注等量LMWH；③ IV+LMWH組：造模成功后關腹，30 min后經靜脈灌注等量LMWH。

1.1.3試劑與藥物 3.5%的牛磺膽酸鈉溶液試劑及生理鹽水(美國Sigma公司)；已配置的1%戊巴比妥鈉及丫啶橙靶向白細胞染料(上海化學試劑公司)；高三酰甘油特質高脂飼料(20%豬油+10%膽固醇+1%丙基硫氧嘧啶+1%膽酸鈉+68.9%普通飼料)；Pentax ISC-1000型激光共聚焦顯微鏡(中國科學技術大學生命科學實驗中心)；LMWH(Alfa Wassermann公司)。

1.2實驗方法各組倉鼠在造模前均禁食12 h，自由飲水。最終篩選出高脂飼料喂養的倉鼠后使用1%戊巴比妥鈉(0.3 mg/100 g)腹腔麻醉，平臥固定，備皮、消毒、鋪巾，經上腹部劍突下橫行正中切口進腹，切口約2～3 cm，顯露肝下間隙，暴露十二指腸，將十二指腸翻出體外。先找到肝總管，用無創血管夾夾閉近端，然后用密閉式靜脈留置針(24GA×0.75IN Y型)從十二指腸壁進入胰膽管，向胰膽管內推進5 mm，見膽汁和胰液流出后，用細絲線在壺腹部乳頭開口處結扎防止注射液回流；同時于膽總管上端用小動脈夾鉗夾閉，防止注射液上行流入肝內，將3.5%牛磺膽酸鈉溶液用微量注射泵恒速注入胰膽管內，用量1 ml/kg體重，以0.2 ml/min的速度注射完畢，保持壓力8 min后除去血管夾，拔出針頭。造模完畢，暫時關閉腹腔防止體液丟失。實驗過程中小鼠背部皮下注射生理鹽水補充血容量，維持中心靜脈壓(CVP)在0.532～0.798 kPa及心率(HR)、平均動脈壓(MAP)波動范圍在10%左右。術中胰腺出血、失血過多及死亡倉鼠被剔除出實驗過程。造模后30 min時，充分顯露腹主動脈主干，從腹主動脈插管至近肝動脈處，結扎固定，LAI+LMWH組注入LMWH 20 IU/kg使全身肝素化，LAI+saline組以同樣的方法注入等量生理鹽水，IV+LMWH組經靜脈輸注等量的LMWH，3組均經外周靜脈注入吖啶橙靶向白細胞熒光染料(2 ml/kg)，注射完畢后以激光共聚焦顯微鏡熒光成像系統動態觀察活體動物模型胰腺微循環，檢測微循環血管平均直徑(microvascular diameter，MVD)、功能性毛細血管密度(functional capillary density，FCD)及微循環血流速度(microvessel flow velocity，MFV)、白細胞黏附水平，記錄數據。MVD：選取胰頭部正中邊長為0.5 cm的正方形區域為選定視野，應用圖像分析系統分別測量所選取視野里各10個微循環毛細血管直徑，最后求出平均值為微循環毛細血管直徑(μm)；FCD：應用圖像分析系統計算視野內功能性毛細血管密度(個/mm2)；MFV的測量：固定拍攝速度(capture speed)110 fps，回放速度(play speed)10 fps，回放錄像，在監視器上找出目標微血管，采用陰極射線管群點掃描法進行速度測量(μm/s)；白細胞黏附：觀察后微靜脈血管內皮壁上黏附白細胞，白細胞移動緩慢超過30 s的定義為白細胞黏附，以每平方毫米血管壁黏附白細胞個數計算(個/mm2)。

1.3實驗標本的獲取及檢測置動物于微循環觀察盒中，以鹽水棉棒輕柔，充分顯露模型倉鼠胰體部(在胰體部選取和胰頭、胰尾等距兩點測定，測定時避開大血管或血腫處，最后取平均值作為結果)，分別在4、6 h后于激光共聚焦微循環顯微鏡下，活體觀察吖啶橙靶向白細胞熒光染色后的胰腺微循環形態和血流動力學特點，并檢測胰腺的MVD、FCD、MFV及白細胞黏附，根據不同染色時間、熒光強度、微循環血流速度對物鏡、激光功率、探測針孔、掃描速度各參數綜合調整選擇，獲得理想圖像，固定掃描步進為5 pm，掃描深度100 pm，顯微鏡物鏡放大倍數分別選取×10、×20，活體熒光成像系統進行圖像采集、錄像。試驗后取胰腺組織100 mg，用 10%的甲醛固定，常規包埋切片，HE染色,在透視電鏡下觀察病理改變,由病理科醫師按 Schimidt法進行胰腺組織病理學評分。

2 結果

2.1實驗動物的基線數據各組倉鼠喂養高脂飼料后藥物干預前的原始各觀察指標的胰腺微循環變化情況，對比各組倉鼠喂養高脂飼料后的數據變化，3組飼養后體質量、血清(triglycerides,TG)、血清(amylase,AMS)及胰腺微循環各指標差異無統計學意義。見表1。

2.2造模后各觀察指標變化情況與IV+LMWH 組及LAI+saline組相比，LAI+LMWH組大鼠的MVD、 FCD、MFV有明顯的上升趨勢，差異有統計學意義(P<0.05)；LAI+LMWH組的白細胞黏附數較IV+LMWH 組及LAI+saline下降程度大，差異有統計學意義(P<0.05)；IV+LMWH組與LAI+saline組相比差異無統計學意義；與6 h時的LAI+LMWH組相比，4 h的LAI+LMWH組的MVD、FCD、MFV上升程度更明顯。見表2、圖1。

2.3血清三酰甘油和淀粉酶濃度測定及對比LAI+LMWH組血清TG水平較IV+LMWH組LAI+saline組顯著下降(P<0.000 1)；LAI+LMWH組血清AMS水平較IV+LMWH組和LAI+saline組明顯降低(P<0.000 1)。見表3。

2.4胰腺病理學評分LAI+LMWH組和IV+LMWH組胰腺病理學評分低于LAI+saline組，且LAI+LMWH組的下降程度較IV+LMWH組更大(P<0.000 1)。見表3。LAI+saline組胰腺組織中出現凝固性壞死、小葉結構消失、間質出血、水腫及中性粒細胞和單核細胞浸潤的現象；IV+LMWH 組胰腺組織中出現的少量壞死灶、水腫及中性粒細胞和單核細胞浸潤的炎癥表現；LAI+LMWH組胰腺組織中無明顯壞死及炎癥細胞浸潤，僅見少量水腫癥狀。見圖2。

3 討論

急性胰腺炎在國內發病率很高，近幾年HLAP發病率呈明顯上升趨勢[4]。高脂血癥性胰腺炎是繼膽源性胰腺炎和酒精源性胰腺炎后的又一胰腺炎的常見病種，其發病率占急性胰腺炎發病率的1.3%～3.8%[1]。高脂血癥根據Frederickson的脂蛋白電泳實驗可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ 5種類型，其中Ⅰ、Ⅴ型以三酰甘油升高為顯著特征，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ以單純的膽固醇升高或合并輕微的三酰甘油升高為顯著特征，且Ⅰ、Ⅴ型高脂血癥并發急性胰腺炎的病例居多，因此可以肯定的是高三酰甘油血癥較高膽固醇血癥與急性胰腺炎的關系更為密切。其發病機制為普遍認可的游離脂肪酸(free fatty acid，FFA)作用機制，該機制認為三酰甘油在激素敏感性三酰甘油脂肪酶的作用下生成FFA，且FFA不易溶于水，釋放入血后與血漿清蛋白結合被輸送到全身各組織利用，一般而言在正常情況下1分子清蛋白可與10分子的FFA結合。但是，當發生高三酰甘油血癥時，代謝生成的FFA遠遠超過血漿清蛋白的結合能力，此時FFA大量過剩，就為導致胰腺炎的發生提供了物質基礎。同時大量的FFA對胰腺的腺泡細胞和毛細血管內皮細胞有直接的細胞毒作用，其主要通過白介素(interleukin，IL)-1、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)等細胞因子的生物膜細胞毒作用損傷其生物膜，導致細胞乃至細胞器腫脹變形和細胞膜通透性的增高，最后誘發和加重胰腺的損傷。另外，血液中較高的三酰甘油及FFA加重了血液的黏稠度，同時激活血小板，使其數量大大增加，這時血液自身阻力增大，血流速度緩慢，大量血液淤積于胰腺微循環內，血供受到嚴重影響。當然還可刺激血管產生縮血管物質血栓素A2(TXA2)，使得擴血管物質前列腺素I2明顯減少，導致血管收縮、血栓形成、胰腺微循環障礙，進一步加重了胰腺的損傷。與此同時許多研究[5]顯示，HLAP的發生與氧化應激有著一定的關聯[5]。在氧化應激的過程中，由于活性物質的大量產生，可啟動炎癥網絡系統，加重胰腺腺泡細胞的水腫和壞死，從而引起相應的組織功能障礙。

表1 各組倉鼠喂養高脂飼料后的體重、血清TG、AMS及MVD、FCD、MFV、白細胞黏附數的基線水平±s)

表2 各組倉鼠灌注LMWH和saline后MVD、FCD、MFV、白細胞黏附數比較±s)

表3 血清三酰甘油、淀粉酶水平及胰腺組織病理學評分±s)

圖1 胰腺微循環各指標變化±s)與LAI+saline組比較：#P<0.05；與IV+LMWH組比較：+P<0.05；與6 h LAI+LMWH組比較：*P<0.05

圖2 各組實驗動物胰腺組織病理圖 HE×200

肝素作為一種抗凝藥物在臨床上已廣泛應用，其主要用于治療和預防靜脈血栓以及防止血栓的再發。目前臨床上應用的肝素主要有兩種：普通肝素和LMWH，而LMWH與普通肝素相比具有注射吸收好、半衰期長、生物利用度高、出血副作用少、無需實驗室監測及抗血栓形成能力強等優點。最新研究[6]表明LMWH能與血管內皮細胞結合，保護血管內皮細胞，維持血管內皮細胞的完整性，促進內皮細胞分泌纖溶酶原激活物，抑制血栓素的活化，從而發揮纖溶和抗血栓作用。范欽橋 等[7]研究發現LMWH還可通過抑制核轉錄因子( NF-κB )的活性，從而誘導胰腺腺泡細胞的凋亡，減輕胰腺炎癥程度。與此同時LMWH也可通過拮抗內皮細胞分泌內皮素-1，使微循環的穩定性增加，抑制胰腺分泌和胰酶活性，維持微循環通暢。

目前，在我國大多數的藥物的給藥途徑多為靜脈輸注。但是，對于高脂血癥性胰腺炎而言，靜脈輸注LMWH雖有一定的治療效果，在藥物經過體循環時，大部分被代謝及滅活，最后到達胰腺和胰腺周圍組織的有效藥物濃度大大減少[8]。對于高脂血癥性胰腺炎患者，由于存在嚴重的胰腺微循環障礙，胰腺血流量減少，血流速度降低，血管阻塞，毛細血管血栓形成等，最終導致靜脈輸注的藥物不能在胰腺組織內達到較高的有效治療濃度[9]。相比而言，區域動脈灌注治療可通過動脈導管使得LMWH直接到達病變部位，避免血胰屏障的損害，從而使得藥物在胰腺內達到較高的治療濃度。張世龍 等[10]研究發現，區域動脈灌注LMWH對胰腺炎的微循環障礙改善程度較靜脈輸注效果更加顯著。顧鳳元 等[11]測得區域動脈灌注時，抗生素在胰腺組織中的濃度是全身用藥的3～4倍。本研究顯示LAI+LMWH組與IV+LMWH組相比，LAI改善胰腺微循環障礙的效果更顯著。因此，這也進一步說明了區域動脈灌注LMWH的優越性。對于LMWH的使用時間及使用劑量，至今仍未有統一的結論，多數類似實驗中，LMWH的使用時間一般選擇在造模后2 h或以后，而且劑量為300 IU/kg。而本實驗中使用的LMWH(20 IU/kg)明顯低于該數值，但仍取得良好的治療效果，提示臨床上可以通過更改輸注方式提高藥物療效，減少藥物使用劑量，從而避免潛在的藥物副作用。

盡管LMWH治療HLAP微循環障礙的實驗有很多，但在活體直接觀察胰腺微循環系統的報道相對較少，在本實驗中利用激光共聚焦顯微鏡熒光成像技術動態觀察活體動物模型胰腺微循環系統，發現早期區域動脈灌注LMWH對胰腺微循環障礙改善較靜脈輸注的效果更加顯著，胰腺病理損傷評分明顯降低，這也更好地為臨床應用區域動脈灌注微量LMWH治療HLAP提供了實驗依據。

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