CMIP與MDM2在肝細胞性肝癌中的表達及其臨床意義

王 樾，吳文涌，吳正升，周 鄭，余昌俊，孟翔凌

肝細胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是原發性肝癌的主要類型，在我國HCC是位居第二的癌癥“殺手”[1]。至今HCC的治療尚無突破性進展，因此研究其發生、發展機制，對HCC的治療有著重要意義。腫瘤細胞的無限生長是腫瘤細胞凋亡受抑制的結果，凋亡障礙同腫瘤的發生、發展密切相關[2]。c-maf誘導蛋白(c-maf inducing protein，CMIP)基因作為近年來新發現的一種重要的多功能細胞因子，通過多種途徑促進細胞凋亡，CMIP是否參與了人體惡性腫瘤的發生、發展，尤其是在HCC中CMIP的表達研究，國內外尚未見文獻報道。小鼠雙微體基因(murine double minute 2，MDM2)是一種原癌基因，可抑制野生型p53對細胞生長的抑制作用及誘導凋亡的能力[3]，在腫瘤的發生過程中起重要作用。研究[4-5]表明CMIP和MDM2均參與細胞凋亡過程，但是這兩種基因在HCC發生、發展過程中是否通過凋亡相關通路發揮相互作用未見報道，因此該研究應用免疫組化法從蛋白水平探討兩種基因在HCC發生、發展中的作用，并討論兩蛋白之間相關性，為研究HCC的發生、發展機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1病例資料收集安徽醫科大學第一附屬醫院2011年11月～2013年12月手術切除經病理證實的、臨床病理資料完整的HCC組織存檔蠟塊115例及其相應癌旁正常肝組織(距癌組織邊緣2 cm以上)98例。其中男98例，女17例，年齡27～80(54.02±10.42)歲；腫瘤直徑≤5 cm 61例，>5 cm 54例；乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)陰性19例，陽性96例；有脈管浸潤32例，無脈管浸潤83例；甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)≤400 ng/ml 43例，>400 ng/ml 72例；有肝臟被膜侵犯13例，無肝臟被膜侵犯102例。按照國際抗癌聯盟(UICC，2010年)原發性HCC TNM分期標準[6]進行分期：Ⅰ期53例，Ⅱ期24例，Ⅲ期35例，Ⅳ期3例。病理分級采用Edmondson分級法：Ⅰ～Ⅱ級75例，Ⅲ～Ⅳ級40例。所有患者術前未接受過化療、放療或生物治療等干預措施。所有標本均經10%福爾馬林液固定，石蠟包埋，4 μm厚連續切片，分別做HE染色和免疫組化染色。染色結果由2名經驗豐富的病理科醫師采用雙盲原則評定。

1.2主要試劑和儀器兔抗人CMIP(12851-1-AP)多克隆抗體(即用型)購自美國Proteintech Group公司，工作滴度1 ∶200；鼠抗人MDM2(SMP-14)多克隆抗體(即用型)購自美國Santa Cruz公司，工作滴度1 ∶100；即用型快速免疫組化MaxVisionTM檢測試劑盒(KIT-5020)購自福州邁新公司；DAB(ZLI-9018)顯色劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司；Olympus CX22生物顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.3實驗方法免疫組化染色前常規HE染色，用于病理診斷、分型、分級。免疫組化染色采用EnVision法。主要步驟如下：4 μm厚的石蠟切片65 ℃烤片，常規脫蠟水化后，經檸檬酸鈉緩沖液高壓加熱抗原修復，用3% H2O2作用10 min以除去內源性過氧化物酶。一抗工作液4 ℃過夜孵育，滴加生物素標記的二抗工作液，37 ℃干燥箱孵育30 min，DAB顯色劑顯色，蘇木精復染，常規脫水，透明，封片。光鏡下觀察染色情況，用已知的陽性標本作為陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。

1.4結果判斷CMIP和MDM2蛋白免疫組化均以細胞質內出現明顯的棕黃色顆粒為陽性，進行陽性細胞計數，每張切片隨機選擇5個不重疊高倍視野(×400)，每個視野計數100個以上細胞，將染色強度和陽性細胞百分比結合判斷CMIP和MDM2蛋白免疫組化結果。結果判斷采用半定量積分法：首先將著色強度打分：0分，細胞無著色；1分，細胞著色為淺黃色；2分，細胞著色為棕黃色；3分，細胞著色為棕褐色；染色強度需與背景著色相對比。再按陽性細胞所占百分比打分：0分，陰性；1分，陽性細胞≤10%；2分，陽性細胞11%～50%；3分，陽性細胞51%～ 75%；4分，陽性細胞>75%。據著色強度分值與陽性細胞百分比分值乘積結果分為4個等級：“-”：0～2分；“+”：3～4分；“”：6～8分；“”：9～12分，≥6分為免疫反應陽性。

1.5統計學處理實驗結果使用SPSS 16.0軟件進行統計學分析。計數資料采用χ2檢驗，指標間的相關性分析采用Pearson相關分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1CMIP和MDM2蛋白在HCC及癌旁組織中的表達CMIP蛋白顆粒定位于細胞質，呈棕黃色顆粒狀，陽性細胞呈片狀分布，見圖1。98例癌旁組織中CMIP蛋白全部陽性表達，其中62例癌旁組織染色結果為()；115例HCC組織中CMIP蛋白的陽性表達率為57.39%(66/115)，其中()53例，()13例。MDM2蛋白陽性染色表現為細胞質呈現棕黃色顆粒，片狀分布，MDM2蛋白在HCC和癌旁組織中陽性率分別為57.39%(66/115)和12.24%(12/98)。CMIP和MDM2蛋白在HCC和癌旁組織中的表達均存在顯著性差異(P<0.001)，見表1。

2.2CMIP和MDM2蛋白在HCC中的表達與相關臨床病理參數的關系CMIP蛋白表達與HCC腫瘤大小顯著相關(P<0.01)，與性別、年齡、HBsAg狀況、有無脈管浸潤、AFP水平、有無肝臟被膜侵犯、組織學分級、TNM分期均無關；HCC中MDM2蛋白的表達與患者的性別、年齡、腫瘤大小、HBsAg狀況、有無脈管浸潤、AFP水平、有無肝臟被膜侵犯、組織學分級、TNM分期均無相關性，見表2。

2.3HCC組織中CMIP和MDM2表達的相關性分析在CMIP陽性表達的66例HCC標本中MDM2的陰性表達為30例；而在CMIP陰性表達的49例標本中MDM2的陽性表達為30例，Pearson相關分析顯示HCC中CMIP與MDM2蛋白表達無明顯相關性(r=-0.067，P=0.478)。

圖1 HCC及癌旁組織中CMIP和MDM2蛋白的表達

A：CMIP在HCC中陰性表達；B：CMIP在癌旁組織中的陽性表達；C：MDM2在HCC中陽性表達；D：MDM2在癌旁組織中陰性表達；1：×100；2：×200

表1 HCC和癌旁正常肝組織中CMIP、MDM2蛋白的表達情況

表2 HCC組織中CMIP、MDM2蛋白表達與臨床病理參數的關系

3 討論

腫瘤的發生是一個多基因參與的、多階段的、漸進的過程，這一過程涉及許多基本的細胞機制如增殖、凋亡、代謝等的改變。細胞凋亡是一種由基因調控的細胞主動的、程序化的死亡過程，在機體生長發育、細胞分化和病理狀態中發揮重要作用。細胞凋亡的過程通常是凋亡抑制因子、凋亡促進因子和相應的調節因子等共同作用的結果；細胞凋亡在控制細胞的增殖、腫瘤的發生和發展方面起著重要作用，逃避凋亡是腫瘤細胞的一個重要特征[7]。

Sahali et al[8]在研究特發性腎病綜合征的免疫發病機制過程中分離出一個新的基因，命名為c-mip。c-mip基因位于人類染色體16q24上，編碼蛋白質分子量為86 ku[9-10]。CMIP的生物學功能參與調節人體腎臟組織中的足細胞相關行為，在人體腎臟疾病中發揮著重要作用。研究[4]表明在腎小球足細胞中c-mip通過下調RelA表達抑制了NF-κB活性從而促進細胞凋亡，此外，c-mip增加Bax的表達水平并增強caspase-3的活性，同時降低了Bcl-2表達的水平，同樣發揮促凋亡作用。Gerami et al[11]使用qRT-PCR方法檢測黑色素瘤組織和色素痣組織中CMIP的mRNA水平，結果表明相對于非黑色素瘤病變，CMIP mRNA在黑色素瘤中表達下調。本研究應用免疫組化技術檢測了115例HCC及98例癌旁組織中CMIP蛋白的表達，結果顯示癌旁組織中CMIP蛋白全部陽性表達，而HCC組織中的表達率為57.39%。可見CMIP在正常肝組織中普遍表達，HCC組織中存在高比率的CMIP蛋白缺失表達。提示在HCC的發生過程中，CMIP基因的失活或低表達起著重要作用。此外，本實驗結果顯示CMIP蛋白在HCC組織中的陽性表達與腫瘤大小顯著相關，直徑≤5 cm的陽性率達72.13%，明顯高于直徑>5 cm的陽性率40.74%。提示CMIP不僅參與了HCC的發生，而且與腫瘤細胞的增長和增殖密切相關。

MDM2基因最初是從含有雙微體的小鼠成纖維母細胞中克隆出的一個高度擴增的原癌基因，位于人類12號染色體12q13-14上[12]。MDM2是p53的轉錄靶基因，通過負反饋環路相互調節，MDM2可以降低p53蛋白的水平并抑制其介導的細胞凋亡活性[5]。MDM2可以促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，其生物學作用是增強細胞的生存活力，使細胞生存期延長，促進細胞增生及腫瘤的生長[13]。Song et al[14]采用組織芯片平臺，應用免疫組化法檢測了56例美國和51例亞洲HCC患者中MDM2蛋白表達情況，發現MDM2陽性表達與HCC患者性別、有無血管侵犯、是否HBsAg陽性密切相關，與腫瘤大小、分化程度、有無淋巴結及遠處轉移無明顯相關性。本研究應用免疫組化法顯示MDM2在HCC中的表達水平顯著高于癌旁組織；在分析MDM2表達與HCC臨床病理參數關系時顯示MDM2蛋白陽性表達與本研究中的臨床病理參數均無關，與Zhang et al[15]研究結果一致。這表明MDM2作為癌基因在HCC的發生過程中起重要作用，但MDM2與HCC腫瘤生物學行為關系的研究結論各異，可能與本實驗樣本量較小、單一中心取樣有關。因此MDM2可作為HCC治療的潛在靶點，MDM2蛋白與HCC臨床病理參數的相關性有待于進一步研究。

綜上所述，本研究結果顯示，HCC中CMIP蛋白失表達與MDM2蛋白過表達無明顯相關性，說明雖然二者均參與細胞凋亡，但CMIP和MDM2對HCC的發生、發展可能各自發揮獨立的作用。目前的研究僅限于現象研究，對于CMIP表達缺失導致HCC的發生機制及分子調控網絡，仍然不完全清楚，尚待進一步研究。

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