煙草胞質(zhì)雄性不育系與保持系內(nèi)源植物激素水平差異性研究

陳建國，王建波，胡如忠，陳釗德，楊振智，丁 丁，郭大芳，謝晉云，安開宇，朱列書，彭 妙

(1.畢節(jié)市煙草公司金沙縣分公司，貴州畢節(jié) 551800；2.貴州省煙草公司質(zhì)檢站，貴州貴陽 550081；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖南長沙 410128；4.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科技學(xué)院，湖南長沙 410128)

植物的雄性不育現(xiàn)象通常是指產(chǎn)生的花粉沒有正常的生活力，雄性不育的表現(xiàn)形式有多種，如雄蕊的畸形或缺失，花藥無法正常開裂，無法形成花粉等。一般煙草雄性不育的表現(xiàn)形式為雄蕊的缺失。煙草雄性不育多為細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型。煙草從形成雄蕊原基到形成成熟具有生活力的花粉，在此過程中要經(jīng)歷一系列的生理生化與形態(tài)特征等各個(gè)方面的變化。對(duì)于植物來說這是一個(gè)復(fù)雜的過程，在此過程中出現(xiàn)任何影響，不管是內(nèi)因或外因，植株都不能形成正常的花粉，從而導(dǎo)致雄性不育。植物雄性不育性狀是植物雜種優(yōu)勢利用的重要工具，具有巨大的生產(chǎn)利用價(jià)值。煙草的胞質(zhì)不育現(xiàn)象在煙草的育種應(yīng)用方面有著重要的意義。

煙草雄性胞質(zhì)雄性不育系的形成過程，包括一系列的物質(zhì)和能量代謝，涉及各種復(fù)雜的生理生化反應(yīng)，對(duì)煙草胞質(zhì)雄性不育系及其相應(yīng)保持系的生化指標(biāo)進(jìn)行比較研究，有助于了解煙草胞質(zhì)雄性不育系發(fā)生機(jī)制和有關(guān)代謝過程。物質(zhì)代謝是植物生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，植株間的生理生化差異，必然反映在物質(zhì)代謝的差異上，而植物對(duì)物質(zhì)和能量的代謝和生長發(fā)育均要通過體內(nèi)的內(nèi)源激素的調(diào)節(jié)來實(shí)現(xiàn)。鑒于此，筆者研究了煙草包質(zhì)雄性不育系與其保持系生長期內(nèi)源植物激素含量的變化規(guī)律和激素水平差異，為更好地應(yīng)用煙草的雄性不育現(xiàn)象提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料以煙草雄性不育系及其保持系為供試材料，共設(shè)3個(gè)處理，即MSK326與K326(處理①)、MSK394與K394(處理②)、MS云煙87與云煙87(處理③)。

1.2試驗(yàn)方法采用大田試驗(yàn)，前茬作物為水稻，土壤肥力均勻，地勢平坦，有較好的灌溉條件。采用漂浮育苗的方式。株行距50 cm×120 cm種植。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，四周設(shè)保護(hù)行。基肥中氮肥全部為硝基磷酸銨，磷肥為普鈣，鉀肥為硫酸鉀，硝酸鉀用于追肥，基肥∶追肥=60∶40，追肥分2次施用，其他田間管理同當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉開發(fā)生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范。分別在苗期、團(tuán)棵期與旺長后10 d、現(xiàn)蕾期和中心花開放期取樣，每個(gè)小區(qū)選取5株有代表性的高頻樣品，苗期取整株幼苗的地上部分，團(tuán)棵期與旺長后10 d用直徑為1.5 cm的打孔器取煙株所有功能葉片(需煙樣20.0 g)，現(xiàn)蕾期和中心花開放期取花蕾和所有功能葉片。用超純水洗凈，濾紙吸干，立即放入-80 ℃冰箱保存待測。

1.3內(nèi)源激素的提取、純化、測定樣品的提取、純化和檢測參考王若仲等[1]的方法進(jìn)行。稱取20.0 g新鮮煙樣，迅速放入液氮處理2～3 min，遮光條件下將樣品進(jìn)行真空冷凍干燥。稱取凍干樣品0.50 g左右(精確至0.000 1 g)，樣品中加入預(yù)冷的提取液甲醇∶水∶乙酸(V∶V∶V=15∶4∶1)8 mL，搖勻，-20 ℃避光浸提。將過夜浸提的樣品4 ℃低溫離心20 min，取上清液。殘?jiān)屑尤? mL預(yù)冷的提取液再次提取，振蕩離心20 min，2次重復(fù)，合并上清液，再進(jìn)行真空冷凍離心，去甲醇，待溶液濃縮至3 mL，加入醋酸銨8 mL進(jìn)行復(fù)溶，4 ℃高速離心，取上清液。上清液過SEP-C18小柱，過柱前，小柱先用5 mL甲醇活化，然后用5 mL 1 mol/L乙酸平衡固相萃取柱，平衡后上樣，收集樣品中內(nèi)源激素，先后以6 mL 50%甲醇、5 mL 0.35 mol/L NH4OH的60%甲醇洗脫，合并洗脫液，真空冷凍離心濃縮至干。最后樣品用500 μL的80%甲醇復(fù)溶后高速離心待測。

測定色譜條件如下：流動(dòng)相為A(泵)0.27%三乙胺溶液，pH=3.0，B(泵)乙腈。流速為1 mL/min，柱溫為35 ℃，波長254 nm。用Zorbax SB-C18(4.6 mm × 150 mm，5 μm)色譜柱按表1梯度洗脫。5種激素按照ZRs(反玉米素核苷)、GA(赤霉素)、iPAs(N6-異戊烯腺嘌呤)、IAA(吲哚乙酸)及ABA(脫落酸)的順序出峰，設(shè)定高效液相色譜儀(Agilent 1290，美國)測定波長為254 nm，采用紫外可見檢測器進(jìn)行檢測。

表1 梯度洗脫程序

1.4數(shù)據(jù)處理采用Excel軟件進(jìn)行測定值和平均值的計(jì)算。

2 結(jié)果與討論

2.1不同時(shí)期煙草雄性不育系與其保持系內(nèi)源激素含量變化由表2可知，苗期IAA的含量明顯低于其他時(shí)期。保持系K326葉片中IAA的含量從苗期到中心花開放期逐漸升高，而K394與云煙87則逐漸下降。各不育系材料葉片中的IAA含量變化不大。K326葉片從苗期到中心花開放期的ABA含量有較明顯的上升趨勢，但其他處理沒有明顯的上升或下降的趨勢。各處理在現(xiàn)蕾期和中心花開放期的葉片和花蕾中的ABA含量差別較大，花蕾中的ABA含量明顯高于葉片。各不育系材料葉片中ZRs含量總體表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢，現(xiàn)蕾期葉片中ZRs含量最高。不育系與保持系苗期與團(tuán)棵期ZRs含量均較低。花蕾中的ZRs含量也較低，不育系和保持系同一時(shí)期的葉與花蕾中，葉片的ZRs要明顯高于花蕾。各處理不同生育期iPAs與GA含量無明顯的規(guī)律性變化。

表2 煙草雄性不育系與保持系各時(shí)期內(nèi)源激素含量差異的比較

2.2不同處理保持系與雄性不育系各時(shí)期IAA含量的比值比較從表3可以看出，苗期到中心花開放期葉片中保持系IAA的含量與不育系的比值均大于1，云煙87與MS云煙87在團(tuán)棵期的IAA含量比達(dá)到2.53。各時(shí)期保持系與不育系的IAA含量比值變化差異不大。而在現(xiàn)蕾期與中心花開放期的花蕾中，保持系與不育系的IAA含量比值與其同一時(shí)期的葉片中IAA含量比值相反，保持系與不育系的IAA含量比值小于1。其中，云煙87與MS云煙87中心花開放期的花蕾中的IAA含量比值只有0.33。可以看出煙草保持系與其不育系從苗期到中心花開放期葉片中保持系的IAA 含量高于不育系，而在花蕾中不育系的IAA含量高于保持系。

表3 不同處理保持系與雄性不育系各時(shí)期IAA含量的比值比較

2.3不同處理保持系與雄性不育系各時(shí)期ABA含量的比值比較從表 4可以看出，除K394與MSK394中心花開放期葉片中ABA的值小于1外，其他材料保持系各時(shí)期部位的ABA含量與不育系的比值均大于1。現(xiàn)蕾期的花蕾中各保持系的ABA含量均是不育系A(chǔ)BA含量的2倍以上，其中K394現(xiàn)蕾期花蕾中的ABA含量是MSK394的5.18倍。各處理進(jìn)入中心花開放期后，保持系與不育系的ABA比值縮小。煙草保持系與不育系在生長過程中，葉片和花蕾中的ABA含量保持系均要高于不育系。

表4 不同處理保持系與雄性不育系各時(shí)期ABA含量的比值比較

2.4不同處理保持系與雄性不育系各時(shí)期iPAs含量的比值比較由表5可看出，不同處理現(xiàn)蕾期和中心花開放期的花蕾中保持系與不育系iPAs的含量比均大于1，中心花開放期的花蕾中K326與MSK326、K394與MSK394的iPAs含量比值均大于10。除少數(shù)的幾個(gè)時(shí)期外，不同處理葉片比值均小于1。在現(xiàn)蕾期與中心花開放期，煙草花蕾中的iPAs含量不育系比保持系低。

表5 不同處理保持系與雄性不育系各時(shí)期iPAs含量的比值比較

2.5不同處理保持系與雄性不育系各時(shí)期ZRs含量的比值比較從表6可以看出，保持系與不育系在苗期、旺長10 d、中心花開放期(葉)的ZRs比值均大于1。保持系與不育系在現(xiàn)蕾期花蕾中ZRs比值均小于1。中心花開放期的花蕾除云煙87與MS云煙87的比值大于1外，其他2個(gè)處理的比值小于1，因此可以看出在煙草花蕾中不育系的ZRs含量高于保持系。

表6 不同處理保持系與雄性不育系各時(shí)期ZRs含量的比值比較

2.6不同處理保持系與雄性不育系各時(shí)期ZRs+iPAs含量的比值比較表7表明，從苗期到中心花開放期的葉片中，3個(gè)處理保持系與雄性不育系各時(shí)期ZRs+iPAs含量的比值多數(shù)時(shí)期大于1，有時(shí)小于1。在現(xiàn)蕾期的花蕾中，除云煙87與MS云煙87的比值大于1外，另外2個(gè)處理小于1。在中心花開放時(shí)期的花蕾中，K326與MSK326的比值小于1，其他2個(gè)處理均大于1。

表7 不同處理保持系與雄性不育系各時(shí)期ZRs+iPAs含量的比值比較

2.7不同處理保持系與雄性不育系各時(shí)期GA含量的比值比較從表8可以看出，除K326/MSK326團(tuán)棵期與K394/MSK394中心花開放期GA含量的比值小于1外，各處理其他時(shí)期保持系與不育系葉片中GA含量的比值均大于1。K326與MSK326現(xiàn)蕾期葉片中的GA比值最高，達(dá)2.73。K326與MSK326團(tuán)棵期葉片中的GA比值最低，為0.73。花蕾中保持系與不育系GA含量的比值，K326與MSK326的比值均大于1，而K394與MSK394的比值均小于1，云煙87與MS云煙87的比值現(xiàn)蕾期小于1，而中心花開放期大于1。3個(gè)處理保持系與不育系在現(xiàn)蕾期花蕾中GA的比值，K326與MSK326的比值為1.01，其他2個(gè)處理小于1。中心花開放期的花蕾中，K394與MSK394的比值為0.95，其他2個(gè)處理大于1。

表8 不同處理保持系與雄性不育系各時(shí)期GA含量的比值比較

3 結(jié)論與討論

采用高效液相色譜法測定了3個(gè)處理煙草不育系與保持系材料5種內(nèi)源植物激素的含量，結(jié)果表明內(nèi)源植物激素在不育系與保持系中有較大差異。

(1)保持系與不育系的IAA含量比值在各時(shí)期葉片中均大于1，而花蕾中小于1。在所測的生長期中，保持系葉片中的IAA水平均高于不育系，花蕾和葉片中則相反，不育系花蕾中表現(xiàn)為IAA的積累。但一般在植株中IAA含量高的部位是營養(yǎng)物質(zhì)輸入的“庫”。大量研究表明，許多雄性不育植物種類都是由于IAA的虧缺導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)的輸入不足，花藥的發(fā)育不良，從而導(dǎo)致雄性不育。如CMS玉米[2]、水稻[3]、柑橘[4]、榨菜[5]、小麥[6]等植物都有相同的研究結(jié)果，這些植物的不育系花藥中的IAA水平明顯低于可育植株。但也有些植物的研究結(jié)果相反，如番茄雄性不育突變體sl2以及GMS和CMS油菜的不育系雄蕊中生長素的含量高于相應(yīng)可育系[7-8]，這表明生長素的積累也與雄性不育的發(fā)生相關(guān)聯(lián)，這可能與生長素誘導(dǎo)乙烯產(chǎn)生有關(guān)，而乙烯是公認(rèn)的殺雄劑。但在煙草雄性不育系花蕾中，IAA的積累和育性的表現(xiàn)是否與生長素誘導(dǎo)乙烯產(chǎn)生有關(guān)還要作進(jìn)一步的研究。

(2)各生育期保持系和不育系的ABA含量比值在葉片和花蕾中均大于1。不育系與保持系在現(xiàn)蕾期ABA含量差別最大，現(xiàn)蕾期過后有縮小的趨勢。當(dāng)植物受到環(huán)境脅迫時(shí)，體內(nèi)的ABA會(huì)急劇上升，ABA的積累與抗逆性的增強(qiáng)存在顯著正相關(guān)[9]。煙草雄性不育系的ABA含量要明顯低于保持系，而相應(yīng)的煙草雄性不育系的抗逆性比保持系低。在生長發(fā)育的過程遇到復(fù)雜的環(huán)境，低水平的ABA可能導(dǎo)致不育系的抗逆性差，這可能是導(dǎo)致其雄性器官發(fā)育不良的原因之一。

(3)ZRs與iPAs都屬于細(xì)胞分裂素類。細(xì)胞分裂素的主要生理效應(yīng)是促進(jìn)細(xì)胞的分裂。不同作物種類雄性的育性與細(xì)胞分裂素含量的關(guān)系不一致。如番茄[7]、榨菜[10]雄性不育株中細(xì)胞分裂素含量低于可育株；而CMS玉米[1]、辣椒[11]以及K、T型CMS小麥[6]的不育系花藥組織或者花蕾與可育系相比，卻表現(xiàn)為內(nèi)源細(xì)胞分裂素類物質(zhì)的積累。該試驗(yàn)測得數(shù)據(jù)顯示，在煙草不育系與保持系的生長發(fā)育的過程中，葉片中的ZRs含量多表現(xiàn)為保持系高于不育系，而在花蕾中則表現(xiàn)為不育系低于保持系，在煙草不育系與保持系生長發(fā)育的過程中，葉和花蕾的ZRs含量表現(xiàn)出不同的規(guī)律。而iPAs則與ZRs大致呈相反的變化規(guī)律。在葉片中多數(shù)時(shí)期保持系要低于不育系，而在花蕾中則反之。iPAs在不育系煙株中的積累與ZRs在煙草不育系中的虧缺，特別是在花蕾中，可能與不育系植株的不育表現(xiàn)有關(guān)。

(4)不育系與保持系的GA含量比較顯示，在生育期內(nèi)

不育系GA含量表現(xiàn)出無規(guī)律的升高或降低，3個(gè)處理多數(shù)時(shí)期不育系GA含量低于保持系，低濃度的GA可能是與煙草的雄性不育有關(guān)，具體機(jī)制可作進(jìn)一步的研究討論。

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