煙草胞質雄性不育系與保持系內源植物激素水平差異性研究

陳建國，王建波，胡如忠，陳釗德，楊振智，丁 丁，郭大芳，謝晉云，安開宇，朱列書，彭 妙

(1.畢節市煙草公司金沙縣分公司，貴州畢節 551800；2.貴州省煙草公司質檢站，貴州貴陽 550081；3.湖南農業大學農學院，湖南長沙 410128；4.湖南農業大學生物科技學院，湖南長沙 410128)

植物的雄性不育現象通常是指產生的花粉沒有正常的生活力，雄性不育的表現形式有多種，如雄蕊的畸形或缺失，花藥無法正常開裂，無法形成花粉等。一般煙草雄性不育的表現形式為雄蕊的缺失。煙草雄性不育多為細胞質雄性不育類型。煙草從形成雄蕊原基到形成成熟具有生活力的花粉，在此過程中要經歷一系列的生理生化與形態特征等各個方面的變化。對于植物來說這是一個復雜的過程，在此過程中出現任何影響，不管是內因或外因，植株都不能形成正常的花粉，從而導致雄性不育。植物雄性不育性狀是植物雜種優勢利用的重要工具，具有巨大的生產利用價值。煙草的胞質不育現象在煙草的育種應用方面有著重要的意義。

煙草雄性胞質雄性不育系的形成過程，包括一系列的物質和能量代謝，涉及各種復雜的生理生化反應，對煙草胞質雄性不育系及其相應保持系的生化指標進行比較研究，有助于了解煙草胞質雄性不育系發生機制和有關代謝過程。物質代謝是植物生命活動的基礎，植株間的生理生化差異，必然反映在物質代謝的差異上，而植物對物質和能量的代謝和生長發育均要通過體內的內源激素的調節來實現。鑒于此，筆者研究了煙草包質雄性不育系與其保持系生長期內源植物激素含量的變化規律和激素水平差異，為更好地應用煙草的雄性不育現象提供理論依據。

1 材料與方法

1.1試驗材料以煙草雄性不育系及其保持系為供試材料，共設3個處理，即MSK326與K326(處理①)、MSK394與K394(處理②)、MS云煙87與云煙87(處理③)。

1.2試驗方法采用大田試驗，前茬作物為水稻，土壤肥力均勻，地勢平坦，有較好的灌溉條件。采用漂浮育苗的方式。株行距50 cm×120 cm種植。試驗設3次重復，四周設保護行?；手械嗜繛橄趸姿徜@，磷肥為普鈣，鉀肥為硫酸鉀，硝酸鉀用于追肥，基肥∶追肥=60∶40，追肥分2次施用，其他田間管理同當地優質煙葉開發生產技術規范。分別在苗期、團棵期與旺長后10 d、現蕾期和中心花開放期取樣，每個小區選取5株有代表性的高頻樣品，苗期取整株幼苗的地上部分，團棵期與旺長后10 d用直徑為1.5 cm的打孔器取煙株所有功能葉片(需煙樣20.0 g)，現蕾期和中心花開放期取花蕾和所有功能葉片。用超純水洗凈，濾紙吸干，立即放入-80 ℃冰箱保存待測。

1.3內源激素的提取、純化、測定樣品的提取、純化和檢測參考王若仲等[1]的方法進行。稱取20.0 g新鮮煙樣，迅速放入液氮處理2～3 min，遮光條件下將樣品進行真空冷凍干燥。稱取凍干樣品0.50 g左右(精確至0.000 1 g)，樣品中加入預冷的提取液甲醇∶水∶乙酸(V∶V∶V=15∶4∶1)8 mL，搖勻，-20 ℃避光浸提。將過夜浸提的樣品4 ℃低溫離心20 min，取上清液。殘渣中加入5 mL預冷的提取液再次提取，振蕩離心20 min，2次重復，合并上清液，再進行真空冷凍離心，去甲醇，待溶液濃縮至3 mL，加入醋酸銨8 mL進行復溶，4 ℃高速離心，取上清液。上清液過SEP-C18小柱，過柱前，小柱先用5 mL甲醇活化，然后用5 mL 1 mol/L乙酸平衡固相萃取柱，平衡后上樣，收集樣品中內源激素，先后以6 mL 50%甲醇、5 mL 0.35 mol/L NH4OH的60%甲醇洗脫，合并洗脫液，真空冷凍離心濃縮至干。最后樣品用500 μL的80%甲醇復溶后高速離心待測。

測定色譜條件如下：流動相為A(泵)0.27%三乙胺溶液，pH=3.0，B(泵)乙腈。流速為1 mL/min，柱溫為35 ℃，波長254 nm。用Zorbax SB-C18(4.6 mm × 150 mm，5 μm)色譜柱按表1梯度洗脫。5種激素按照ZRs(反玉米素核苷)、GA(赤霉素)、iPAs(N6-異戊烯腺嘌呤)、IAA(吲哚乙酸)及ABA(脫落酸)的順序出峰，設定高效液相色譜儀(Agilent 1290，美國)測定波長為254 nm，采用紫外可見檢測器進行檢測。

表1 梯度洗脫程序

1.4數據處理采用Excel軟件進行測定值和平均值的計算。

2 結果與討論

2.1不同時期煙草雄性不育系與其保持系內源激素含量變化由表2可知，苗期IAA的含量明顯低于其他時期。保持系K326葉片中IAA的含量從苗期到中心花開放期逐漸升高，而K394與云煙87則逐漸下降。各不育系材料葉片中的IAA含量變化不大。K326葉片從苗期到中心花開放期的ABA含量有較明顯的上升趨勢，但其他處理沒有明顯的上升或下降的趨勢。各處理在現蕾期和中心花開放期的葉片和花蕾中的ABA含量差別較大，花蕾中的ABA含量明顯高于葉片。各不育系材料葉片中ZRs含量總體表現為先上升后下降的趨勢，現蕾期葉片中ZRs含量最高。不育系與保持系苗期與團棵期ZRs含量均較低。花蕾中的ZRs含量也較低，不育系和保持系同一時期的葉與花蕾中，葉片的ZRs要明顯高于花蕾。各處理不同生育期iPAs與GA含量無明顯的規律性變化。

表2 煙草雄性不育系與保持系各時期內源激素含量差異的比較

2.2不同處理保持系與雄性不育系各時期IAA含量的比值比較從表3可以看出，苗期到中心花開放期葉片中保持系IAA的含量與不育系的比值均大于1，云煙87與MS云煙87在團棵期的IAA含量比達到2.53。各時期保持系與不育系的IAA含量比值變化差異不大。而在現蕾期與中心花開放期的花蕾中，保持系與不育系的IAA含量比值與其同一時期的葉片中IAA含量比值相反，保持系與不育系的IAA含量比值小于1。其中，云煙87與MS云煙87中心花開放期的花蕾中的IAA含量比值只有0.33?？梢钥闯鰺煵荼３窒蹬c其不育系從苗期到中心花開放期葉片中保持系的IAA 含量高于不育系，而在花蕾中不育系的IAA含量高于保持系。

表3 不同處理保持系與雄性不育系各時期IAA含量的比值比較

2.3不同處理保持系與雄性不育系各時期ABA含量的比值比較從表 4可以看出，除K394與MSK394中心花開放期葉片中ABA的值小于1外，其他材料保持系各時期部位的ABA含量與不育系的比值均大于1?，F蕾期的花蕾中各保持系的ABA含量均是不育系ABA含量的2倍以上，其中K394現蕾期花蕾中的ABA含量是MSK394的5.18倍。各處理進入中心花開放期后，保持系與不育系的ABA比值縮小。煙草保持系與不育系在生長過程中，葉片和花蕾中的ABA含量保持系均要高于不育系。

表4 不同處理保持系與雄性不育系各時期ABA含量的比值比較

2.4不同處理保持系與雄性不育系各時期iPAs含量的比值比較由表5可看出，不同處理現蕾期和中心花開放期的花蕾中保持系與不育系iPAs的含量比均大于1，中心花開放期的花蕾中K326與MSK326、K394與MSK394的iPAs含量比值均大于10。除少數的幾個時期外，不同處理葉片比值均小于1。在現蕾期與中心花開放期，煙草花蕾中的iPAs含量不育系比保持系低。

表5 不同處理保持系與雄性不育系各時期iPAs含量的比值比較

2.5不同處理保持系與雄性不育系各時期ZRs含量的比值比較從表6可以看出，保持系與不育系在苗期、旺長10 d、中心花開放期(葉)的ZRs比值均大于1。保持系與不育系在現蕾期花蕾中ZRs比值均小于1。中心花開放期的花蕾除云煙87與MS云煙87的比值大于1外，其他2個處理的比值小于1，因此可以看出在煙草花蕾中不育系的ZRs含量高于保持系。

表6 不同處理保持系與雄性不育系各時期ZRs含量的比值比較

2.6不同處理保持系與雄性不育系各時期ZRs+iPAs含量的比值比較表7表明，從苗期到中心花開放期的葉片中，3個處理保持系與雄性不育系各時期ZRs+iPAs含量的比值多數時期大于1，有時小于1。在現蕾期的花蕾中，除云煙87與MS云煙87的比值大于1外，另外2個處理小于1。在中心花開放時期的花蕾中，K326與MSK326的比值小于1，其他2個處理均大于1。

表7 不同處理保持系與雄性不育系各時期ZRs+iPAs含量的比值比較

2.7不同處理保持系與雄性不育系各時期GA含量的比值比較從表8可以看出，除K326/MSK326團棵期與K394/MSK394中心花開放期GA含量的比值小于1外，各處理其他時期保持系與不育系葉片中GA含量的比值均大于1。K326與MSK326現蕾期葉片中的GA比值最高，達2.73。K326與MSK326團棵期葉片中的GA比值最低，為0.73。花蕾中保持系與不育系GA含量的比值，K326與MSK326的比值均大于1，而K394與MSK394的比值均小于1，云煙87與MS云煙87的比值現蕾期小于1，而中心花開放期大于1。3個處理保持系與不育系在現蕾期花蕾中GA的比值，K326與MSK326的比值為1.01，其他2個處理小于1。中心花開放期的花蕾中，K394與MSK394的比值為0.95，其他2個處理大于1。

表8 不同處理保持系與雄性不育系各時期GA含量的比值比較

3 結論與討論

采用高效液相色譜法測定了3個處理煙草不育系與保持系材料5種內源植物激素的含量，結果表明內源植物激素在不育系與保持系中有較大差異。

(1)保持系與不育系的IAA含量比值在各時期葉片中均大于1，而花蕾中小于1。在所測的生長期中，保持系葉片中的IAA水平均高于不育系，花蕾和葉片中則相反，不育系花蕾中表現為IAA的積累。但一般在植株中IAA含量高的部位是營養物質輸入的“庫”。大量研究表明，許多雄性不育植物種類都是由于IAA的虧缺導致營養物質的輸入不足，花藥的發育不良，從而導致雄性不育。如CMS玉米[2]、水稻[3]、柑橘[4]、榨菜[5]、小麥[6]等植物都有相同的研究結果，這些植物的不育系花藥中的IAA水平明顯低于可育植株。但也有些植物的研究結果相反，如番茄雄性不育突變體sl2以及GMS和CMS油菜的不育系雄蕊中生長素的含量高于相應可育系[7-8]，這表明生長素的積累也與雄性不育的發生相關聯，這可能與生長素誘導乙烯產生有關，而乙烯是公認的殺雄劑。但在煙草雄性不育系花蕾中，IAA的積累和育性的表現是否與生長素誘導乙烯產生有關還要作進一步的研究。

(2)各生育期保持系和不育系的ABA含量比值在葉片和花蕾中均大于1。不育系與保持系在現蕾期ABA含量差別最大，現蕾期過后有縮小的趨勢。當植物受到環境脅迫時，體內的ABA會急劇上升，ABA的積累與抗逆性的增強存在顯著正相關[9]。煙草雄性不育系的ABA含量要明顯低于保持系，而相應的煙草雄性不育系的抗逆性比保持系低。在生長發育的過程遇到復雜的環境，低水平的ABA可能導致不育系的抗逆性差，這可能是導致其雄性器官發育不良的原因之一。

(3)ZRs與iPAs都屬于細胞分裂素類。細胞分裂素的主要生理效應是促進細胞的分裂。不同作物種類雄性的育性與細胞分裂素含量的關系不一致。如番茄[7]、榨菜[10]雄性不育株中細胞分裂素含量低于可育株；而CMS玉米[1]、辣椒[11]以及K、T型CMS小麥[6]的不育系花藥組織或者花蕾與可育系相比，卻表現為內源細胞分裂素類物質的積累。該試驗測得數據顯示，在煙草不育系與保持系的生長發育的過程中，葉片中的ZRs含量多表現為保持系高于不育系，而在花蕾中則表現為不育系低于保持系，在煙草不育系與保持系生長發育的過程中，葉和花蕾的ZRs含量表現出不同的規律。而iPAs則與ZRs大致呈相反的變化規律。在葉片中多數時期保持系要低于不育系，而在花蕾中則反之。iPAs在不育系煙株中的積累與ZRs在煙草不育系中的虧缺，特別是在花蕾中，可能與不育系植株的不育表現有關。

(4)不育系與保持系的GA含量比較顯示，在生育期內

不育系GA含量表現出無規律的升高或降低，3個處理多數時期不育系GA含量低于保持系，低濃度的GA可能是與煙草的雄性不育有關，具體機制可作進一步的研究討論。

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