正交試驗設計優化木瓜多糖提取工藝

李寶珠，蘇詩蟠，王中來，胡育梅

(1.福州大學生物科學與工程學院，福建福州 350116；2.泉州醫學高等專科學校檢驗預防學院，福建泉州 362000；3.廈門伯賽基因轉入技術有限公司，福建廈門 361002；4.福州大學至誠學院生物工程系，福建福州 350002)

木瓜多糖能夠清除活性氧，如單線態氧、過氧化物、超氧化物、羥基自由基及過氧亞硝基[1]。而活性氧與癌癥、心臟病及其他疾病有著重要的聯系，可以作為一種潛在的藥物制劑原材料。為了對木瓜多糖進行深入全面的研究，發揮其更多的價值，就必須先獲得高純度的木瓜多糖。因此，探究影響木瓜多糖得率的影響因素至關重要。

筆者將對木瓜多糖的提取影響因素進行初步研究。在木瓜多糖的常規法提取和含量測定的基礎上對其進行了超聲波輔助提取，用蒽酮-硫酸法[2-5]測定木瓜多糖的得率，采用L27(313)正交試驗分析浸提溫度、浸提時間、固液比和超聲波處理時間這4個因素對多糖提取率的影響，同時考慮浸提溫度與浸提時間、固液比、超聲波處理時間的交互作用，采用方差分析的方法，確定其最佳工藝條件[6-10]。以期得出木瓜多糖提取的最佳工藝，為木瓜的開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1原料及預處理。將超市購買的新鮮海南木瓜洗凈去皮去籽后，切成厚2～5 mm的片狀果肉，置于恒溫60 ℃的烘箱中烘干至恒重，經粉碎機粉碎后過40目篩，收集粉末，存儲于干燥器中。精確稱取1.00 g木瓜粉并按比例加入蒸餾水，經超聲波處理10 min后在水浴鍋中浸提一段時間。浸提液用高速離心機進行離心10 min，轉速12 000 r/min，洗滌液和濾液并入，最后定容稀釋，得到木瓜多糖的粗提取液。

1.1.2主要試劑與儀器。濃硫酸(分析純)、蒽酮(分析純)、無水葡萄糖(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；MILLI-Q超純水機，美國MILLIPORE公司；電子天平，北京塞多利斯儀器系統有限公司；冷凍干燥機，美國LABCONCO公司；多功能粉碎機，上海市浦恒信息科技有限公司。

1.2標準曲線的制作準確稱取250 mg無水葡萄糖粉末加蒸餾水溶解后定容于500 mL容量瓶中，充分搖勻，制得濃度為0.5 mg/mL的標準葡萄糖溶液。分別移取1.00、2.00、3.00、4.00、6.00、8.00 mL標準葡萄糖溶液于50 mL容量瓶中，配制成濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.06、0.08 mg/mL的葡萄糖溶液。分別移取2 mL不同濃度梯度的葡萄糖溶液至10 mL具塞試管中，同時置于冰浴中，每管分別加入4 mL濃度為2.00 mg/mL的蒽酮-硫酸溶液，加塞密封并搖勻。以蒸餾水作為對照組，每個濃度設置3個平行試驗。將試驗組與對照同時放入沸水浴中，當水溫達到100 ℃時開始計時，10 min后取出，置于冰水中迅速冷卻至室溫，充分搖勻放置10 min，于波長625 nm處測定吸光值。測得的葡萄糖標準曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Glucose standard curve

1.3正交試驗設計采用4因素3水平正交試驗，考察超聲波處理時間(A)、浸提時間(B)、固液比(C)和浸提溫度(D)對木瓜多糖提取率的影響，同時考察因素之間可能的交互作用(AB、AC和AD)。選用L27(313)正交表進行正交試驗，共有27組試驗組合。各因素考察3個水平如表1所示。

表1木瓜多糖提取工藝正交試驗因素水平設計

Table1Orthogonaltestfactorandleveldesignforpolysaccharideextractionofpapayafructuschaenomelislagenariae

水平Level因素Factor超聲時間Ultrasonictime(A)min浸提時間Extractiontime(B)∥min固液比Solid-liquidratio(C)mg/mL浸提溫度Extractiontemperature(D)∥℃120301∶3060230601∶4070340901∶5080

2 結果與分析

根據正交表安排試驗，同時留取3列空白，作為誤差估計。按正交表實施試驗，共27個組合，獲取各組合的提取率。正交試驗安排和木瓜多糖提取率見表2。

對試驗結果進行方差分析，考察各個因素對木瓜多糖提取率的影響。方差分析結果顯示，FA=9.36**，FB=5.54*，FAB=6.45**,FC=4.14*,FAD=9.89**,F0.05(2,12)=3.89,F0.01(2,12)=6.93,F0.05(4,12)=3.26,F0.01(4,12)=5.41。由方差分析中的顯著性可得到，AD、A和AB在0.01水平上高度顯著，B和C在0.05水平上顯著，而AC對指標的影響不顯著，可忽略不計，并入誤差。雖然浸提溫度(D)不顯著，但是其與超聲波處理時間(A)的交互作用是顯著的，所以該因素不能忽略。因此，超聲波處理時間(A)、浸提時間(B)、固液比(C)和浸提溫度(D)，在0.05水平對木瓜多糖提取率均有影響。

木瓜多糖的提取率越高越有利，即目標遵循望大準則[11-12]。因此，可根據各因素與交互作用的指標和，確定最優工藝條件組合，見表3。

根據各因素的指標和，初選優水平：由表3可知，根據A、B、C和D 3個因素的最大指標和，其初選優水平分別為A3、B3、C1和D3。因素和交互作用的主次順序：由方差分析可知，根據F值大小，因素和交互作用的主次順序依次為AD、A、AB、B、C 。

表2 木瓜多糖提取的正交試驗

表3 因素與交互作用的指標和

根據交互作用的指標和，以及因素和交互作用的主次順序，確定優水平。由表3可知，AD的優水平為3，又因AD在主次順序中排第1位，因此A和D應該取A3和D3，顯然與上文中初選出的優水平相吻合。

由表3可知，AB的優水平為2，又因AB在主次順序中排在B之前，因此B的優水平應該由AB決定，取B2。顯然優于上文中初選出的優水平B3，因為此時平均指標和大于表3中B3的最大指標和。

因素C的優水平：因素C為不顯著因素，從節能角度考慮，應該取最小固液比，即C1。此時，正好與表3中的最大指標和水平相一致。

綜上所述，最優水平組合為A3B2C1D3，即最優工藝條件為超聲波處理時間40 min、浸提時間60 min、固液比1∶30 mg/mL和浸提溫度80 ℃。最后，在最佳條件A3B2C1D3下，進行3次重復試驗，測定多糖得率為15.2%。

3 結論

通過考慮交互作用并設計使用L27(313)正交表的4因素3水平正交試驗，確定木瓜多糖提取的最優工藝條件為超聲波處理時間40 min、浸提時間60 min、固液比1∶30 mg/mL和浸提溫度80 ℃。最后，在此最佳條件下進行3次重復試驗，測定多糖得率為15.2%。

該研究采用L27(313)正交試驗設計，并考慮因素間的交互作用，確定木瓜多糖提取的最優工藝條件，為木瓜多糖的開發利用提供技術指導。后期可以進一步研究，采用響應面試驗方法，找出各個因素的操作空間，將更有利于工業化開發。

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