正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化木瓜多糖提取工藝

李寶珠，蘇詩蟠，王中來，胡育梅

(1.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建福州 350116；2.泉州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校檢驗(yàn)預(yù)防學(xué)院，福建泉州 362000；3.廈門伯賽基因轉(zhuǎn)入技術(shù)有限公司，福建廈門 361002；4.福州大學(xué)至誠學(xué)院生物工程系，福建福州 350002)

木瓜多糖能夠清除活性氧，如單線態(tài)氧、過氧化物、超氧化物、羥基自由基及過氧亞硝基[1]。而活性氧與癌癥、心臟病及其他疾病有著重要的聯(lián)系，可以作為一種潛在的藥物制劑原材料。為了對木瓜多糖進(jìn)行深入全面的研究，發(fā)揮其更多的價(jià)值，就必須先獲得高純度的木瓜多糖。因此，探究影響木瓜多糖得率的影響因素至關(guān)重要。

筆者將對木瓜多糖的提取影響因素進(jìn)行初步研究。在木瓜多糖的常規(guī)法提取和含量測定的基礎(chǔ)上對其進(jìn)行了超聲波輔助提取，用蒽酮-硫酸法[2-5]測定木瓜多糖的得率，采用L27(313)正交試驗(yàn)分析浸提溫度、浸提時(shí)間、固液比和超聲波處理時(shí)間這4個(gè)因素對多糖提取率的影響，同時(shí)考慮浸提溫度與浸提時(shí)間、固液比、超聲波處理時(shí)間的交互作用，采用方差分析的方法，確定其最佳工藝條件[6-10]。以期得出木瓜多糖提取的最佳工藝，為木瓜的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1原料及預(yù)處理。將超市購買的新鮮海南木瓜洗凈去皮去籽后，切成厚2～5 mm的片狀果肉，置于恒溫60 ℃的烘箱中烘干至恒重，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過40目篩，收集粉末，存儲于干燥器中。精確稱取1.00 g木瓜粉并按比例加入蒸餾水，經(jīng)超聲波處理10 min后在水浴鍋中浸提一段時(shí)間。浸提液用高速離心機(jī)進(jìn)行離心10 min，轉(zhuǎn)速12 000 r/min，洗滌液和濾液并入，最后定容稀釋，得到木瓜多糖的粗提取液。

1.1.2主要試劑與儀器。濃硫酸(分析純)、蒽酮(分析純)、無水葡萄糖(分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；MILLI-Q超純水機(jī)，美國MILLIPORE公司；電子天平，北京塞多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；冷凍干燥機(jī)，美國LABCONCO公司；多功能粉碎機(jī)，上海市浦恒信息科技有限公司。

1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作準(zhǔn)確稱取250 mg無水葡萄糖粉末加蒸餾水溶解后定容于500 mL容量瓶中，充分搖勻，制得濃度為0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。分別移取1.00、2.00、3.00、4.00、6.00、8.00 mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液于50 mL容量瓶中，配制成濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.06、0.08 mg/mL的葡萄糖溶液。分別移取2 mL不同濃度梯度的葡萄糖溶液至10 mL具塞試管中，同時(shí)置于冰浴中，每管分別加入4 mL濃度為2.00 mg/mL的蒽酮-硫酸溶液，加塞密封并搖勻。以蒸餾水作為對照組，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)。將試驗(yàn)組與對照同時(shí)放入沸水浴中，當(dāng)水溫達(dá)到100 ℃時(shí)開始計(jì)時(shí)，10 min后取出，置于冰水中迅速冷卻至室溫，充分搖勻放置10 min，于波長625 nm處測定吸光值。測得的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Glucose standard curve

1.3正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用4因素3水平正交試驗(yàn)，考察超聲波處理時(shí)間(A)、浸提時(shí)間(B)、固液比(C)和浸提溫度(D)對木瓜多糖提取率的影響，同時(shí)考察因素之間可能的交互作用(AB、AC和AD)。選用L27(313)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，共有27組試驗(yàn)組合。各因素考察3個(gè)水平如表1所示。

表1木瓜多糖提取工藝正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

Table1Orthogonaltestfactorandleveldesignforpolysaccharideextractionofpapayafructuschaenomelislagenariae

水平Level因素Factor超聲時(shí)間Ultrasonictime(A)min浸提時(shí)間Extractiontime(B)∥min固液比Solid-liquidratio(C)mg/mL浸提溫度Extractiontemperature(D)∥℃120301∶3060230601∶4070340901∶5080

2 結(jié)果與分析

根據(jù)正交表安排試驗(yàn)，同時(shí)留取3列空白，作為誤差估計(jì)。按正交表實(shí)施試驗(yàn)，共27個(gè)組合，獲取各組合的提取率。正交試驗(yàn)安排和木瓜多糖提取率見表2。

對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，考察各個(gè)因素對木瓜多糖提取率的影響。方差分析結(jié)果顯示，F(xiàn)A=9.36**，F(xiàn)B=5.54*，F(xiàn)AB=6.45**,FC=4.14*,FAD=9.89**,F0.05(2,12)=3.89,F0.01(2,12)=6.93,F0.05(4,12)=3.26,F0.01(4,12)=5.41。由方差分析中的顯著性可得到，AD、A和AB在0.01水平上高度顯著，B和C在0.05水平上顯著，而AC對指標(biāo)的影響不顯著，可忽略不計(jì)，并入誤差。雖然浸提溫度(D)不顯著，但是其與超聲波處理時(shí)間(A)的交互作用是顯著的，所以該因素不能忽略。因此，超聲波處理時(shí)間(A)、浸提時(shí)間(B)、固液比(C)和浸提溫度(D)，在0.05水平對木瓜多糖提取率均有影響。

木瓜多糖的提取率越高越有利，即目標(biāo)遵循望大準(zhǔn)則[11-12]。因此，可根據(jù)各因素與交互作用的指標(biāo)和，確定最優(yōu)工藝條件組合，見表3。

根據(jù)各因素的指標(biāo)和，初選優(yōu)水平：由表3可知，根據(jù)A、B、C和D 3個(gè)因素的最大指標(biāo)和，其初選優(yōu)水平分別為A3、B3、C1和D3。因素和交互作用的主次順序：由方差分析可知，根據(jù)F值大小，因素和交互作用的主次順序依次為AD、A、AB、B、C 。

表2 木瓜多糖提取的正交試驗(yàn)

表3 因素與交互作用的指標(biāo)和

根據(jù)交互作用的指標(biāo)和，以及因素和交互作用的主次順序，確定優(yōu)水平。由表3可知，AD的優(yōu)水平為3，又因AD在主次順序中排第1位，因此A和D應(yīng)該取A3和D3，顯然與上文中初選出的優(yōu)水平相吻合。

由表3可知，AB的優(yōu)水平為2，又因AB在主次順序中排在B之前，因此B的優(yōu)水平應(yīng)該由AB決定，取B2。顯然優(yōu)于上文中初選出的優(yōu)水平B3，因?yàn)榇藭r(shí)平均指標(biāo)和大于表3中B3的最大指標(biāo)和。

因素C的優(yōu)水平：因素C為不顯著因素，從節(jié)能角度考慮，應(yīng)該取最小固液比，即C1。此時(shí)，正好與表3中的最大指標(biāo)和水平相一致。

綜上所述，最優(yōu)水平組合為A3B2C1D3，即最優(yōu)工藝條件為超聲波處理時(shí)間40 min、浸提時(shí)間60 min、固液比1∶30 mg/mL和浸提溫度80 ℃。最后，在最佳條件A3B2C1D3下，進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，測定多糖得率為15.2%。

3 結(jié)論

通過考慮交互作用并設(shè)計(jì)使用L27(313)正交表的4因素3水平正交試驗(yàn)，確定木瓜多糖提取的最優(yōu)工藝條件為超聲波處理時(shí)間40 min、浸提時(shí)間60 min、固液比1∶30 mg/mL和浸提溫度80 ℃。最后，在此最佳條件下進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，測定多糖得率為15.2%。

該研究采用L27(313)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并考慮因素間的交互作用，確定木瓜多糖提取的最優(yōu)工藝條件，為木瓜多糖的開發(fā)利用提供技術(shù)指導(dǎo)。后期可以進(jìn)一步研究，采用響應(yīng)面試驗(yàn)方法，找出各個(gè)因素的操作空間，將更有利于工業(yè)化開發(fā)。

[1] 江蘇省植物研究所.新華本草綱要：第3冊[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1990.

[2] 徐懷德，秦盛華.超聲波輔助提取光皮木瓜多糖及其體外抗氧化性研究[J].食品科學(xué)，2010，31(10)：106-111.

[3] 劉曉涵，陳永剛，林勵(lì)，等.蒽酮硫酸法與苯酚硫酸法測定枸杞子中多糖含量的比較[J].食品科技，2011，34(9)：270-272.

[4] 魏苑，張盛貴.蒽酮-硫酸法測枸杞多糖含量的研究[J].食品工業(yè)科技，2011，32(3)：399-401.

[5] 王文平，郭祀遠(yuǎn)，李琳，等.野木瓜水溶性多糖的提取、分離及結(jié)構(gòu)分析[J].華南理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2008，36(7)：128-132.

[6] 劉瑞江，張業(yè)旺，聞崇煒，等.正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析方法研究[J].實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理，2010，27(9)：52-55.

[7] NALBANT M，G?KKAYA H，SUR G.Application of Taguchi method in the optimization of cutting parameters for surface roughness in turning[J].Materials & design，2007，28(4)：1379-1385.

[8] 王中來，李葉桃，王團(tuán)結(jié)，等.關(guān)于正交配置表構(gòu)造中若干問題的探討[J].福州大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，27(1)：100-105.

[9] 王中來，李育偉，葉長燊.正交配置表的構(gòu)造及其在吸附偏微分方程數(shù)值解中的應(yīng)用[J].離子交換與吸附，1998，14(1)：59-67.

[10] CAI D J，SHU Q，XU B Q，et al.Orthogonal test design for optimization of the extraction of flavonid from the fructus gardeniae[J].Biomedical & environmental sciences，2011，24(6)：688-693.

[11] 陳魁.試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析[M].北京：清華大學(xué)出版社，1996.

[12] 閔亞能.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(DOE)應(yīng)用指南[M].北京：機(jī)械工業(yè)出版社，2011.