COL6A3基因多態性與中國散發孤立性肌張力障礙的關聯

馬凌燕，馬惠姿，馮濤

首都醫科大學附屬北京天壇醫院神經變性病科，北京市100050

肌張力障礙(dystonia)是一種以持續或間歇性肌肉收縮所致的動作和/或姿勢異常為特征的運動障礙，常反復發作，有典型發作模式和肢體扭曲，并可伴有震顫[1-2]。孤立性肌張力障礙(isolated dystonia)臨床上僅表現為肌張力障礙，包括扭轉痙攣、眼瞼痙攣、口下頜肌張力障礙、痙攣性斜頸、痙攣性構音障礙、書寫痙攣等。孤立性肌張力障礙是一類病理生理復雜、機制未明的運動障礙性疾病，研究表明多數患者存在基因異常的生理基礎。目前研究發現，20余種基因與肌張力障礙相關[3-6]，但大多數散發孤立性肌張力障礙患者致病基因檢出率低，可能與多種因素有關。單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)作為人類可遺傳變異中最常見的一種，常用來評估人群遺傳易感性。已發現十余個SNP與孤立性肌張力障礙相關，其中 rs1801968(D216H)[7]、rs1182[8]、rs3842225[9]與局灶型或節段型肌張力障礙相關，rs6265(BNDF Val66met)與伴有上肢震顫的痙攣性斜頸相關[9-10]。

Zech等[11]采用全外顯子測序對德國一個常染色體隱性遺傳早發型肌張力障礙家系進行分析，發現COL6A3可能是其致病基因。該基因位于2q37，包含43個外顯子，編碼Ⅵ型膠原蛋白α3亞單位。另有研究對955例肌張力障礙患者進行COL6A3基因41和42外顯子篩查，未檢測到明確致病突變，提示突變概率極低[12]。

散發肌張力障礙占肌張力障礙的多數，從遺傳易感性SNP入手研究COL6A3基因與肌張力障礙相關性成為可能。本研究從遺傳易感性方面探討COL6A3基因多態性與中國人群散發孤立性肌張力障礙的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2014年9月至2017年8月就診于首都醫科大學附屬北京天壇醫院神經內科運動障礙病門診的散發孤立性肌張力障礙患者127例，否認家族類似病史。根據受累部位，局灶型肌張力障礙87例(痙攣性斜頸45例，顱段肌張力障礙39例，書寫痙攣2例，痙攣性構音障礙1例)，節段型肌張力障礙31例，全身型肌張力障礙9例。全部患者均符合肌張力障礙的診斷標準[1]，并通過病史、體格檢查和輔助檢查排除繼發性肌張力障礙，包括圍產期損傷、中毒外傷史、服用抗精神病藥物、查體存在病理征、影像學檢查提示基底節區存在可以解釋相關癥狀的異常信號、血液檢查(銅藍蛋白、血清銅、24 h尿銅、有機酸等)異常及其他可導致肌張力障礙的疾病。所有患者均排除DYT1/TOR1A及DYT6/THAP1異常。

同期130例既往健康，無神經系統疾病，性別、年齡與患者匹配的健康體檢者作為對照組。兩組一般資料見表1。

所有受試者均簽署知情同意書。本研究方案經首都醫科大學附屬北京天壇醫院倫理委員會審核通過。

表1 受試者一般資料比較

1.2 SNP篩選

參考Hapmap計劃篩選標準，在千人基因組數據庫(http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens/Info/Index)中進行COL6A3基因41外顯子SNP篩選，以總體人群、歐洲人群、非洲人群、美洲人群、亞洲南部人群及亞洲東部人群最小等位基因頻率(minor allele frequency,MAF)＞0.05為標準選取目標SNP。

1.3 限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)

受試者采集靜脈血2～3 ml，應用QIAGEN全基因組DNA提取試劑盒從全血中提取基因組DNA。PCR-RFLP檢測COL6A3基因多態性。采用Primer 5.0軟件設計引物。

1.4 統計學分析

采用SPSS 13.0統計軟件進行數據處理。χ2擬合優度檢驗計算Hardy-Weinberg平衡。計量資料采用方差分析，基因型和等位基因頻率比較采用χ2檢驗。對于不同基因型(3組)間發病年齡比較，數據符合正態分布，采用單因素方差分析。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 目標SNP

共得到符合條件SNP位點2個，分別為rs1131296和rs2270669，它們在亞洲東部人群的MAF分別為0.4802、0.7312。

rs1131296引物序列：上游5'-TCC CAT TTC CAT TCT GTG TTT-3'，下游5'-TTC ACA TTT CAT GTA TGC TGATAGA-3'。

rs2270669引物序列：上游5'-TCC CAT TTC CAT TCT GTG TTT-3'，下游5'-TTC ACA TTT CAT GTA TGC TGATAGA-3'。

2.2 基因型及等位基因頻率分布

兩組Val66Met位點基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡。見表2。rs1131296在病例組和對照組中GG、GA、AA基因型分布，以及等位基因頻率無顯著性差異(P＞0.05)。rs2270669在病例組和對照組中CC、CG、GG基因型分布，以及等位基因頻率無顯著性差異(P＞0.05)。見表2。

表2 兩組基因型及等位基因頻數比較(n)

2.3 不同基因型間起病年齡

病例組中，rs1131296 GG型起病年齡(42.86±14.79)歲，GA型(38.36±12.34)歲，AA型(40.58±15.78)歲(F=0.100,P=0.905)。rs2270669 CC型起病年齡(39.58±15.12)歲，CG型(40.36±13.59)歲，GG型(42.58±10.73)歲(F=0.074,P=0.929)。2個SNP中3個基因型患者起病年齡無顯著性差異(P＞0.05)。

3 討論

本研究顯示，肌張力障礙患者基因型和等位基因分布與對照組無顯著性差異，各基因型間起病年齡也無顯著性差異，提示COL6A3基因41外顯子多態性與我國散發孤立性肌張力障礙無關。

Zech等[11,13]發現COL6A3基因復合雜合突變可能與常染色體隱性遺傳肌張力障礙有關。在3個存在COL6A3基因突變的德國家系共5例患者中，所有患者均為早發型肌張力障礙，起病年齡＜25歲；其中3例以斜頸起病，2例以手部肌張力障礙起病，癥狀可在數年內逐漸進展至身體其他部分，表現為局灶型或節段型肌張力障礙。這3個家系中共存在5個突變，分 別 為 c.9128G＞A(p.Arg3043His)+c.9245C＞G(p.Pro3082Arg)、c.8966-1G＞C(p.Val2989_Lys3077delins-Glu)+c.7502G＞A(p.Arg2501His)、 c.8966-1G＞C(p.Val2989_Lys3077delinsGlu) + c.7660G＞A (p.Ala2554Thr)，所有患者均在41號外顯子存在基因突變。此后其對367名孤立性肌張力障礙患者和376名正常對照進行COL6A3基因篩查，發現2例COL6A3基因突變所致肌張力障礙患者和另外43個突變位點(雜合子)，患者雜合子檢出率為9.5%(35/367)，對照組檢出率為6.1%(23/376)[11,14]。

COL6A3基因位于2q37，包含43個外顯子，編碼Ⅵ型膠原蛋白α3亞單位[15-16]。該蛋白為異源三聚體，是一種細胞外基質(extra cellular matrix,ECM)蛋白，能夠產生微纖維網絡結構，在全身各處均有表達，成年大鼠腦中以腦干和中腦表達量最高[11]。ECM在中樞神經系統參與神經發育和退行病變[17-18]。在中樞神經系統中，膠原蛋白不僅發揮結構連接功能，而且廣泛參與細胞生理過程，包括神經環路形成和維持[19-20]。

Ⅵ型膠原蛋白由3個α鏈組成，α1(Ⅵ)、α2(Ⅵ)、和α3(Ⅵ)，分別由 COL6A1、COL6A2和COL6A3基因編碼，每個都有N-末端和C-末端非膠原結構域，由三螺旋結構連接。以前的研究發現，COL6A3基因突變與神經系統疾病有關，特別是骨骼肌疾病，如Ullrich先天肌萎縮和Bethlem肌病[7-8,15,21]。但COL6A3基因突變的肌張力障礙患者MRI未見肌肉萎縮征象。另外發現，所有COL6A3型肌張力障礙患者至少存在1個影響41號外顯子的突變位點(位于41號外顯子內或其內含子中)，推測肌張力障礙發病可能與該外顯子編碼蛋白結構域受損有關。

突觸可塑性受損是肌張力障礙發病機制之一[22-25]。COL6A3基因41號外顯子編碼Ⅵ型膠原蛋白α3的部分C4結構域(FN-Ⅲ模體)，可能參與突觸結構可塑性而發病[26]。推測與肌張力障礙發病相關的COL6A3基因突變發生在α3(Ⅵ)鏈的C-末端，至少有1個突變位點位于41號外顯子，而肌病相關的致病突變多位于N-末端和三螺旋結構內[27-30]，基因突變部位不同而導致不同疾病，并可將肌張力障礙與其他肌肉疾病加以區分。COL6A3基因突變所致肌張力障礙在同一家系中表現非常相似，但不同家系差異較大。

目前僅有一項肌張力障礙COL6A3基因篩查研究[12]，納入955例孤立性或混合性肌張力障礙患者(898例高加索人種，57例亞洲人，不含中國)，首先對COL6A3基因的41和42號外顯子進行篩查，對篩查出的9例突變攜帶者檢測其余41個外顯子，未發現致病突變，提示COL6A3基因非肌張力障礙常見致病原因。

SNP作為人類可遺傳變異中最常見的一種，常用來評估人群中遺傳易感性。已發現十余個SNP與孤立性肌張力障礙相關，但不同基因、不同人群結果差異較大。目前尚無關于COL6A3基因多態性與肌張力障礙相關性研究。鑒于既往研究提示COL6A3基因41號外顯子可能在肌張力障礙的發生發展中發揮重要作用，我們對41號外顯子進行SNP篩查，發現2個多態性位點：rs1131296和rs2270669。研究顯示，這兩個位點SNP均與中國散發孤立性肌張力障礙無關。

本研究存在一定局限性。本研究是基于醫院的病例-對照研究，選擇偏倚難以避免；多態性位點位于COL6A3基因41號外顯子上，可能不能完全代表整個基因易感性情況。尚需大規模研究支持。

本研究顯示，COL6A3基因41外顯子多態性并非中國孤立性肌張力障礙人群的遺傳易感因素。今后可擴展至COL6A3基因多個多態性位點，在不同人群、大樣本病例研究中證實。

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