湖泊微擬球藻高含油突變株的構建及篩選

張玲香　陳怡雯　胡晗華

(1. 中國科學院水生生物研究所藻類生物學重點實驗室, 武漢 430072; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

微擬球藻(Nannochloropsis)是一類屬于真眼點藻綱(Eustigmatophyceae)、球形或近似球形的單細胞真核生物, 該屬有7個已定種(N. gaditana、N. salina、N. oculata、N. oceanica、N. australis、N.granulata和N. limnetica)[1,2], 其中僅有1個種類為淡水類型[3]。與該屬中的海洋種類相似, 淡水的湖泊微擬球藻(N. limnetica)也具有較高的光合作用效率、生物量和油脂含量, 并富含二十碳五烯酸(EPA)[4—6]。作為最有潛力的工業產油的模式研究類群[7], 迄今該屬多個海洋種類的全基因組序列已經公布[8—10], 它們的遺傳轉化體系也已建立[8,9,11]。

當前, 由于生物燃料生產的成本遠高于化石燃料, 且微藻培養過程中消耗的僅與產出的能量相當,使得生物燃料包括微藻生物質僅在替代減排上具有一定的優勢[12]。將微藻生物質生產與污水處理相結合, 可在減少碳排放的同時增加經濟效益, 由此使得利用微藻作為生產生物質的原料變得經濟可行。因而, 從污水處理角度考慮, 研究利用淡水種類作為生物質原料具有更大的優勢。由于湖泊微擬球藻的全基因組序列沒有公布, 無法有效通過對靶基因的操作改良藻細胞的產油性狀。本文利用電擊轉化的方法, 將zeocin抗性基因隨機插入湖泊微擬球藻的基因組, 構建突變體庫, 通過篩選得到油含量及生長顯著增加的突變株, 為快速獲取優良目的性狀的高產油突變株提供了一種有效途徑。

1　材料與方法

1.1　藻株和培養

湖泊微擬球藻(Nannochloropsis limnetica KR 1998/3)由德國淡水生態和內陸漁業研究所(Institute of Freshwater Ecology and Inland Fisheries, Neuglobsow) Lothar Krienitz教授提供, 經稀釋涂平板純化后得到無菌藻落。常規培養使用BG11培養基,在溫度為22℃、光強約為50 μmol photons/(m2·s)、光暗周期L∶D為16∶8的條件下進行。固體培養基加1.2%的瓊脂, 轉化子在加1 μg/mL zeocin的平板上篩選。從平板上挑取轉化子接種至48孔板(每孔含添加了0.5 μg zeocin的1 mL液體培養基)中培養15d后用于鑒定。經鑒定的陽性轉化子接入盛120 mL BG11培養基(將NaNO3濃度減少到882 μmol/L)的250 mL三角瓶中靜置培養, 用于三酰基甘油相對含量及生物量(OD730)的分析。用于總脂、三酰基甘油及其脂肪酸組成分析的藻細胞在通空氣的條件下培養。

1.2　質粒構建

以湖泊微擬球藻基因組DNA為模板, 用引物tub-fw (5′-atgcTCCGGAATCATATCGTGCCACA GCAGATTGG-3′, 下劃線為Aor13H I酶切位點)和tub-rv (5′-agctTGGCCATGGTTGAGACTAGTTG GAGGGAGG-3′, 下劃線為Bal I酶切位點)進行PCR擴增得到β-tubulin啟動子區域(約570 bp)[11]。PCR產物經測序驗證后純化回收, 用Aor13H I和Bal I酶切, 與經同樣雙酶切后回收的pPha-T1載體大片段相連, 以替換其中的fcpB啟動子片段(位于抗性基因sh ble上游), 得到質粒pPha-T1-TUB。

1.3　電擊轉化方法

通過電擊轉化野生型湖泊微擬球藻的方法參照文獻[11]進行, 略有修改。簡述如下： 生長至對數期藻細胞收集后用375 mmol/L山梨醇溶液洗滌3次并重懸, 加入3—5 μg用Sca I線性化的pPha-T1-TUB質粒DNA, 最終懸浮液體積為200 μL, 轉至2 mm電擊杯中。電擊參數及電擊后藻細胞處理與已報道的對海洋微擬球藻種類的轉化流程相同[8,9,11]。

1.4　PCR擴增

用CTAB法提取基因組DNA。以野生型為陰性對照, 質粒pPha-T1-TUB為陽性對照, 分別以tubfw和FcpAt_rv (5′-TCGAGAAAACTCATCCTGT GC-3′)為配對引物, 通過PCR的方法檢測轉化子。50 μL PCR反應體系含有25 μL 2×PCR Mix(擎科生物)、引物各100 pmol和50 ng DNA模板。PCR反應程序為： 94℃變性5min, 接下來是34個循環反應(94℃變性30s, 60℃復性30s, 72℃延伸1min), 最后是72℃延伸10min。

1.5　突變株生長及含油量分析

相對生物量通過測定培養液的OD730值獲得。分別在培養的第10和第12天收集相同量的藻細胞,按照Bligh和Dyer[13]的方法提取總脂。總脂在薄層層析(TLC)板上展層后分析三酰基甘油的相對含量[14]。薄層層析板的型號是Silica gel 60 F254 (Merk KgaA Darmstadt, Germany), 展層劑體系為正己烷∶乙醚∶乙酸(70∶30∶1, v/v/v)。展層結束后層析板置于含有適量顆粒碘的燒杯中顯色5—10min[15]。標準品三油酸甘油酯(Glyceryl trioleate)購自Sigma公司。采用稱重法確定總脂和用薄層層析板回收的三酰基甘油的絕對含量。

1.6　脂肪酸組成分析

總脂和三酰基甘油甲酯化后用正己烷萃取3次,合并有機相, 取1 μL用Ultra Trace氣相色譜分析儀(Thermo Scientific, United States)進行脂肪酸組成分析。用面積歸一法計算各脂肪酸組分的相對百分比。

2　結果與討論

2.1　湖泊微擬球藻突變體庫的構建

自2011年Killian等[16]利用電擊的方法在海洋微擬球藻(N. oceanica)中建立起高效的遺傳轉化體系以來, 該屬中另外4個海洋種類的遺傳轉化方法也已被陸續報道[8,11]。南方微擬球藻(N. australis)是最近才被鑒定的一個新種, 與海洋微擬球藻有非常近的親緣關系, 因而兩者的轉化程序應該相同。我們采用同樣的轉化策略, 構建帶有zeocin抗性基因的質粒, 由湖泊微擬球藻β-tubulin基因的啟動子驅動表達, 轉化后可篩選得到陽性轉化子。初步計算轉化效率僅為海洋種類的約1%, 因而轉化方法尚待進一步優化。微擬球藻屬的種類具有厚的細胞壁, 電轉化需要很高的電場強度(通常為11000—12000 V/cm)[16], 而對淡水種類而言, 由于滲透壓等因素的不同, 可能需要對電場強度等電擊參數進行優化。

從平板上挑取的轉化子接入zeocin濃度為0.5 μg/mL的BG11培養基中培養, 以便進一步篩選。連續傳代6個月后, 我們共獲得了約300個可在含有抗性的液體培養基中生長的轉化子, 將這些作為突變子庫, 用于篩選具有優良產油性狀的突變株。從中隨機選取30個突變株, 以其基因組DNA為模板, 以tub-fw和FcpAt_rv為引物進行PCR擴增檢查zeocin抗性基因及終止子序列片段(共約1.2 kb)。結果表明, 所有30個抗性藻落均可擴增出目的片段, 得到了可穩定遺傳的轉化子。

2.2　高含油突變株的篩選

由于BG11培養基中的氮濃度高達17.6 mmol/L,培養早期收獲檢測到的湖泊微擬球藻僅含很低的三酰基甘油[17]。將起始硝酸鹽的濃度降低至882 μmol/L (與海水培養基f/2中的氮濃度一致), 培養湖泊微擬球藻, 淡水的微擬球藻三酰基甘油含量與海洋的微擬球藻相當[18]。對上述隨機挑選的30個突變株與野生型在氮濃度為882 μmol/L的條件下培養, 利用薄層層析比較三酰基甘油含量, 培養10d的結果顯示共有16個突變株的三酰基甘油含量高于野生型, 培養12d共有14個突變株的三酰基甘油含量高于野生型, 10d和12d檢測的油含量均高于野生型的突變株有11株, 占比為37%。其中突變株G5的油含量在12 d比野生型增加超過50% (圖 1)。

大量的研究顯示藻細胞油脂積累與生長之間不具有同步性[19]。各種脅迫(尤其是氮限制)可導致TAG積累, 但嚴重阻礙藻的生長。利用基因工程手段提高細胞油脂含量通常也會導致細胞生長受到影響。為獲得生長不受影響的高含油突變株, 我們進一步比較了野生型與突變株的生長情況。如圖 2所示, 9個突變株的相對生物量高于野生型, 其余21株的生長均受到不同程度抑制, 其中K36的生物量僅為野生型的約40%。

綜合油含量及生長的結果, 9個生長優于野生型的突變株中, K14、K24、K26、K29和G5等5株的油含量也高于野生型, 占所有分析突變株的約17%。K26和G5兩個突變株的相對生物量分別比野生型增加約5%—10%和3%—6%。

2.3　兩個高含油突變株的產油特性

將上述2個生長及油含量優于野生型的突變株K26和G5在通空氣的條件下培養7d, 收獲藻細胞用于分析總脂、三酰基甘油含量及其脂肪酸組成。表 1顯示, 在本研究條件下培養的湖泊微擬球藻總脂的含量為22%—26%, 略低于海洋微擬球藻的總脂含量[18]。2個突變株的三酰基甘油均高于野生型,含量占總脂的一半左右。湖泊微擬球藻總脂中的脂肪酸以C16∶0 、C16∶1和C20∶5為主, 三者之和占總脂肪酸的70%以上。另外2種含量較高的脂肪酸為C14∶0和C18∶1, 尤其是在三酰基甘油中所占的比例較高。與野生型比, 突變株總脂的C20∶5較低, 特別是突變株G5中C20∶5的含量僅為野生型的約40%, 相應地C18∶1的含量增加了一倍多。突變株中豐富的短鏈脂肪酸組成特性符合作為生物柴油原料的標準。

通過生理脅迫或對相應靶基因的遺傳操作均可促進微藻細胞油脂的積累。然而, 前者嚴重抑制細胞的生長, 后者通常也會影響藻細胞的生長。由于生長和油脂積累的不同步性, 在不影響或是增加細胞生長的同時提高細胞油脂積累可能涉及多個基因的協同作用。因而, 有目的地通過基因工程手段對產油性狀進行改良不但需要長時間的多次嘗試, 也可能需要多個抗性篩選標記。通過隨機插入突變, 從大量突變子庫中篩選生長和油含量均顯著增加的方法是切實可行的有效手段[20,21]。由于外源基因多拷貝的隨機插入, 盡管不易確定影響性狀的目的基因, 但至少可以獲得對目標性狀顯著改良的突變株。通過本研究建立的突變株篩選方法, 可以快速獲得具有優良產油性狀的藻株。進一步, 通過對插入位點的深入分析還可以確定影響生長及油脂合成的相關基因, 闡明藻細胞的油脂代謝機理,為更有效地改造湖泊微擬球藻產油性狀提供理論支撐。

圖 1　野生型和突變株培養10d(上)和12d(下)后提取總脂的硅膠板薄層層析圖Fig. 1　Lipid composition and content in mutants and wild type (WT) of Nannochloropsis limnetica at day 10 and 12

圖 2　野生型和突變株培養10d和12d后相對生物量(OD730)的比較Fig. 2　The relative biomass (OD730) in mutants and wild type (WT) of Nannochloropsis limnetica at day 10 and 12

表 1　野生型湖泊微擬球藻與富油突變株K26和G5的總脂與三酰基甘油脂肪酸組成及含量Tab. 1　Fatty acid composition (mol %) in total lipids and triacylglycerol (TAG) of mutants (strains K26 and G5) and wild type (WT) of Nannochloropsis limnetica

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