多酚與蛋白質相互作用研究方法進展

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(肉品加工與質量控制教育部重點實驗室,南京農業大學食品科技學院,江蘇南京 210095)

多酚是植物體內復雜酚類的次生代謝產物,廣泛存在于各種植物中,具有抗氧化、降血壓、抗癌、抑菌消炎、抗輻射、預防動脈粥樣硬化等生理功能[1-4],現已成為科學界研究熱點。研究表明:多酚能與多糖、蛋白質、生物堿等多種化合物結合,其中蛋白質作為生命活動的物質基礎,是生物體內功能性高分子物質,幾乎在所有的生命活動中都發揮著重要作用。因此,多酚與蛋白質相互作用來調控食品營養[5-7]、風味[8-9]和品質[10-12]等方面的研究逐步升溫,而且隨著科學技術的發展,不斷有新的技術應用到此方面的研究。

目前,多酚與蛋白質相互作用主要測定指標有結合常數、結合部位、作用力類型、結合位點數、多酚與蛋白結合后引起蛋白構象和生理功能變化以及外界條件對多酚-蛋白結合的影響等,進而研究多酚與蛋白結合機制。多酚與蛋白相互作用研究方法多種多樣,如平衡透析法[13]、電化學方法[14]、光譜法、液相色譜法[15]、原子力顯微鏡技術[16]等。隨著實驗技術和儀器設備的不斷發展,分子對接、質譜[17]、核磁共振波譜法、毛細管電泳[18]等方法也逐漸運用到此研究領域,這不僅有利于開展小分子物質作用機理的研究,且在改進蛋白質-多酚復合物檢測、藥物代謝動力學等方面的研究都有十分重大的作用。本文主要介紹分子對接、紫外-可見吸收光譜、熒光光譜、圓二色譜、傅里葉變換紅外光譜、等溫滴定量熱法、拉曼光譜、核磁共振波譜對多酚和蛋白質相互作用的研究,旨在為多酚與蛋白質相互作用的后續研究提供方法借鑒,也為食品加工中多酚-蛋白質對產品品質影響的分析提供指導。

1 分子對接

分子對接的最初思想起源于E.Fisher提出的“鑰匙-鎖模型”,即受體與配體相互識別的首要條件是空間結構的匹配。分子對接技術是通過不斷優化小分子化合物的位置(取向)以及分子內部柔性鍵的二面角(構象),計算其相互作用及結合能,尋找出小分子化合物與靶標大分子作用的最佳構象[19],可以利用計算機模擬代替試驗操作,短時間內能夠處理大量的試驗組數據,可以有效提高科研效率,但因無法考慮離子強度、溫度等因素對相互作用的實際影響,還需結合實驗結果進行驗證分析。

通過對多酚與蛋白質分子對接結果進行分析,可以得出多酚與蛋白質之間的結合自由能、結合位點和相互作用力等,從理論上模擬相互作用的可行性和作用情況。Ayah等[20]對牛α-乳白蛋白(α-LA)與表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯(EGCG)進行分子對接研究,結果闡述了EGCG淬滅α-LA固有熒光的原因。Motokazu等[21]對EGCG和外膜通道蛋白OmpG進行分子對接分析,發現EGCG通過氫鍵與孔道中心的Arg殘基發生作用,從而阻塞外膜通道,抑制通道蛋白功能,因此可以根據EGCG通過外膜孔蛋白進入周質層的量,來闡明EGCG是否抑制細胞分裂,可以為EGCG在革蘭氏陽性細菌中的抗菌機理提供研究方向。金建昌等[22]利用分子對接技術得出EGCG與β-乳球蛋白(β-LG)之間作用力主要為疏水作用,同時也與β-LG中的氨基酸殘基形成的氫鍵和靜電作用,結果經驗證與熒光猝滅的結果基本吻合;楊榮榮[23]研究槲皮素與牛血清白蛋白(BSA)的結合特性,分子對接得出兩者作用力為疏水作用,同時存在氫鍵與靜電作用,與光譜試驗的結果對應一致;而張麗嬌[24]通過光譜技術和分子對接技術對6組不同類型的小分子與FTO蛋白的相互作用進行研究,得出FTO蛋白與各類型小分子的相互作用機理。以上試驗均驗證了分子對接模擬結果的有效性與可靠性。

2 紫外-可見吸收光譜

紫外-可見吸收光譜法是研究200～800 nm波長光區內物質分子由于電磁輻射作用導致價電子躍遷而產生的吸收光譜,其光譜圖可以反映出分子內共軛體系的結構信息[25]。其機理是蛋白質中含有多種生色基團具有各種微環境,微環境的性質由蛋白質分子的整個構象所決定,當多酚與蛋白發生相互作用時,必定會對分子的微觀結構產生影響,則微環境隨之改變,生色基團的紫外吸收譜圖可顯示相應的變化[26]。因此,可根據譜圖變化的信息對分子間相互作用的機理、作用部位、作用程度等進行判斷和分析。紫外-可見吸收光譜法是目前研究多酚與蛋白質相互作用較基礎的方法且簡單、快捷,檢出限低。

紫外-可見吸收光譜法是用于研究小分子與蛋白相互作用,判斷復合型形成以及蛋白質構象變化的一種簡單有效的方法。楊榮榮[23]發現槲皮素與BSA分子發生相互作用形成基態配合物引起BSA吸收峰發生藍移,最大波長λmax和吸收強度均發生改變,說明槲皮素可以與BSA發生作用,對食品加工中提高脂溶性多酚利用率提供指導。Mohd 等[27]研究表明添加鞣酸(TA)后,人血清白蛋白(HSA)的最大吸收峰和吸收強度受到輕微影響,主要是靠近色氨酸殘基的蛋白質構象發生了變化。紫外-可見吸收光譜還可輔助判斷多酚與蛋白質的熒光淬滅機理,計算出兩者結合常數。薛斐[28]發現隨著黃酮類化合物的加入,與肥胖蛋白FTO發生作用,FTO 的構象發生了改變,生成新的復合物,且初步判斷出三種黃酮類化合物對 FTO 的猝滅機制為靜態猝滅。Imed Hasni等[29]通過紫外-可見吸收光譜計算酪蛋白與不同茶多酚的結合常數來分析復合物的穩定性,與熒光法計算結果相比沒有明顯的差異。申炳俊等[30]研究柚皮素與HSA的結合模型,其結果同樣表明紫外與熒光光譜法結果相符,無明顯差異。由此可知,利用紫外-可見吸收光譜法可以有效研究蛋白質構象變化,與其他方法相結合可以得出多酚與蛋白質的作用機理。

3 熒光光譜

某些物質被一定波長的光照射(或者吸收電磁輻射)后會受到激發,被激發的分子或原子從第一激發單重態的最低振動能級回到基態各振動能級時所產生的光輻射稱為熒光。熒光分析法靈敏度高,選擇性好,尤其在有機物檢測分析方面,其靈敏度通常比其他微量分析法高兩三個數量級。此外,該方法操作簡便、重復性好、線性范圍寬,但該方法對環境極為敏感,酸度、污染物及溫度等干擾會限制此方法的使用。熒光光譜分析法可以通過記錄熒光的強度、波長、偏振和壽命等熒光特性參數來做定性檢測和定量測定,還可以作為一種表征技術研究體系的物理、化學性質及其變化情況[31]。

通過對多酚與蛋白的熒光分析可以判斷熒光猝滅類型,確定結合位置和作用力,測定結合常數和結合位點數,定性描述蛋白質的構象變化等。喬華等[32]采用熒光光譜法研究高良姜素與 BSA 的結合作用,發現高良姜素對 BSA 有較強的熒光猝滅作用,且為靜態猝滅,兩者通過范德華力和氫鍵產生了較強的結合作用,結合常數在 106數量級,結合位點數約為 1,結合位點為 BSA 疏水空腔的 Site Ⅰ。Hu等[33]利用熒光光譜研究生理條件下綠原酸(CGA)與HSA的特異性結合,得到了CGA對HSA的熒光猝滅機理與結合常數,并結合熱力學參數研究判斷該結合反應是自發的,靜電相互作用在反應中起主要作用。Marija等[34]應用Stern-Volmer方程分析可知pH的變化會引起β-LG構象轉變位點附近的結合參數發生改變,并且蛋白質發射光譜中340 nm峰強度降低,這是Trp19的二聚誘導的自猝滅的結果。周瑞等[35]利用熒光光譜分析不同溶液對BSA與花青素相互作用的影響,結果顯示溶液的改變沒有影響兩者的相互作用方式,依然為氫鍵和范德華力,但隨著溶液離子強度的變化,兩者之間的結合常數和結合距離會發生變化。劉建壘等[36]通過熒光光譜分析得到BSA與槲皮素(QUE)及花青素(ACN)相互作用方式及納米顆粒特征,進而可以得出其顆粒的穩定性等參數。利用熒光光譜法可以判斷出多酚與蛋白質結合發生的熒光猝滅類型,結合熱力學參數等方法可以判斷該結合反應是否自發進行,并確定多酚與蛋白質相互作用的結合常數和作用力。

4 圓二色譜

蛋白質的圓二色譜分為兩段[37]:一段是185～245 nm,稱為遠紫外區;另一段是245～320 nm,稱為近紫外區。遠紫外區是肽鍵的吸收峰范圍,反映蛋白質主鏈的構象,包括蛋白質二級結構的類型(α-螺旋、β-折疊、β-轉角、無規卷曲)及相對含量[38]。在近紫外區,蛋白質的圓二色性主要由側鏈基團所貢獻,此區域的譜峰可以敏感地反映出蛋白質構象的細微變化。這種方法簡單、快速、準確,而且干擾較少,但價格昂貴。

多酚與蛋白的結合具有選擇性,通過圓二色譜法可以研究不同多酚對不同蛋白的親和力的差異性。Akiko等[39]使用圓二色譜研究EGCG與HAS和BSA的結合,發現EGCG對HSA上的位點I和II具有親和力,而在BSA上觀察到三個位點的競爭性結合。配體結合蛋白導致二級結構變化也可用圓二色譜表征。Liu等[40]發現玉米醇溶蛋白與槲皮素偶聯后,α-螺旋和β-折疊減少,β-轉角和無序卷曲增加,然而玉米醇溶蛋白與EGCG或綠原酸結合后沒有觀察到二級結構的變化,這表明化學反應引起的構象變化受多酚類型的影響。薛燕斌等[41]研究高良姜素與人血清白蛋白之間的相互作用發現不同濃度的高良姜素與HSA結合時會改變HSA的二級結構,但改變幅度不大。Kanakis等[42]利用圓二色譜研究發現茶多酚的結合導致β-乳球蛋白的α-螺旋和β-折疊含量上升,說明茶多酚結合起到穩定β-乳球蛋白結構的作用。Hao等[43]研究表明順式和反式白藜蘆醇分別對α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和BSA的二級結構沒有顯著影響。張冬[44]利用圓二色譜法研究矢車菊素-3-O-葡萄糖苷與BSA的相互作用,得出隨著矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的增多,BSA中α-螺旋結構含量減少,這與紅外光譜反應的結果一致。由此可知,圓二色譜法可以有效的用于分析多酚與蛋白質相互作用導致的蛋白質結構的變化。

5 傅里葉變換紅外光譜

傅里葉紅外光譜法(FTIR)創建于20世紀70年代,屬于第三代紅外光譜儀,其原理是基于光相干性進行設計,光譜是由于分子振動能級躍遷而產生的。該技術具有分辨率高、靈敏度高、波數精度高、掃描速度極快(一般在1 s內可完成全譜掃描)、光譜范圍寬等優點,特別適用于弱紅外光譜測定、紅外光譜的快速測定等,但制樣程序復雜。利用紅外光譜圖吸收峰位置與形狀可以進行定性分析,進而推測出未知物的結構;而根據吸收峰的強度可以進行定量分析[45]。此外,還可以利用紅外光譜在催化、高聚物、絡合物等領域進行結構、聚合過程、反應機理、動力學等方面的研究。

多酚與蛋白質的結合會改變蛋白的二級結構,從而影響蛋白的功能性質,利用FTIR光譜可以定性的分析蛋白質結構變化。Jia等[46]通過酰胺I帶峰值擬合觀察到綠原酸、阿魏酸和表沒食子兒茶素沒食子酸酯分別與β-乳球蛋白結合后,誘導α-螺旋向β-結構轉變,改變了β-乳球蛋白的二級結構。Yang等[47]通過FTIR將純乳鐵蛋白(LF)和EGCG的紅外光譜與復合物LF-EGCG的紅外光譜進行比較,由于酚羥基伸縮,在3476、3365 cm-1和3273 cm-1附近發現了三個典型的EGCG峰,然而在配合物中沒有找到這些高峰,而且在500～1000 cm-1區域的特征帶也有一些變化;定量分析可以發現,隨著EGCG濃度的增加,LF的二級結構組成發生顯著變化。Tang等[48]利用蛋白質紅外酰胺帶I對結構變化的敏感性檢測綠原酸(CA)及其兩種位置異構體新綠原酸(NCA)和隱原酸(CCA)對HSA二級結構的影響,發現分子結構的差異對蛋白質構象產生的變化不同,NCA與CA分子的化學結構高度相似,可以誘導生物大分子發生類似的結構變化,具有4-酯基結構的CCA分子表現出具有更大改變HSA構象的能力。薛瑾[49]利用FTIR分析茶多酚-蛋白納米復合物的二級結構,以探究EGCG結構中的多羥基與蛋白的作用位點及作用類型。在多酚與蛋白質相互作用的研究中,傅里葉紅外光譜法被廣泛應用于蛋白質二級結構變化的分析。

6 等溫滴定量熱法

等溫滴定量熱法(ITC)是近年來發展起來的一種研究生物分子間生物熱力學與生物動力學的重要方法,也是唯一一種能在一次實驗中同時確定所有結合參數的技術,在相關模型生物系統的建立和驗證中起到重要作用。不僅可以測定結合親和力(KA或KD)、化學結合計量比(n)、焓變(ΔH)及熵變(ΔS)等信息[50],還能透過熱力學數據闡明潛在的分子間作用機制,便于更加深入的了解結構-功能的關系。且該技術是以熱效應為基礎,與溶液的性質無關,對被研究體系的溶劑性質、光譜性質和電學性質等沒有任何限制條件,因此可以廣泛應于與非水溶液、膠體溶液與漿狀體系等溶液體系中,可以提供完全無標記且液相的分析環境,同時無需配體或靶點的固定,具有非特異性的獨特優勢,而且還具備了樣品用量小、儀器使用方便、檢測耗時短、方法靈敏度和精確度高等特點,但是對于粒徑較大的蛋白質,難以確定結合位點。

多酚與蛋白質的非共價作用主要源于弱結合,Zerrin等[51]使用熒光探針結合方法和ITC分析來表征綠茶類黃酮和乳蛋白結合的相互作用,ITC數據顯示發生非共價作用,反應是吸熱過程,其疏水作用為主要作用力。Richard等[52]通過ITC進行單寧與BSA和明膠結合的比較,數據表明與BSA相比,縮合單寧與明膠的結合常數大1至2個數量級,氫鍵是縮合單寧與明膠結合的主要作用力,縮合單寧缺乏結構靈活性可能是其對BSA低親和力的一個因素。Elaine等[53]利用ITC研究離子強度和溫度對鞣酸(TA)和植酸(PA)與BSA結合的影響,結果表明高離子強度條件可以促進TA與BSA之間具有更高的親和力,而對于植酸和BSA卻相反,BSA變性點以上的溫度上升有利于其與PA的相互作用,并且不利于TA的作用,這可能是由于蛋白質暴露的結合位點不同。Zhan等[54]通過ITC表明在pH7.0時酪蛋白酸鈉(SC)和TA之間的相互作用是自發放熱過程,并且主要是氫鍵促進自組裝過程。Rudradip等[55]利用ITC研究表明鞣花酸(EA)與HAS兩者相互作用是焓驅動和自發結合的模式,且主要是疏水作用和氫鍵對穩定HSA-EA復合體起著重要作用。由此可知,等溫滴定量熱法可以得出多種結合參數,近幾年被廣泛用于多酚與蛋白質相互作用的研究。

7 拉曼光譜

拉曼光譜是基于頻率為v0光與分子間發生非彈性碰撞的一種散射光譜,會伴隨分子內部的運動(如轉動、振動等)而改變,其本質仍屬于分子光譜。蛋白質在500～1750 cm-1區域的拉曼峰歸屬于主體結構(酰胺鍵鏈接的鏈)和氨基酸側鏈,以及環狀結構的特定氨基酸,如酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。低于700 cm-1的拉曼光譜譜帶是由含硫基團C-S和S-S拉伸模式引起[56]。拉曼光譜提供快速、簡單、可重復且無損傷的定性定量分析,可用于估計蛋白質的二級結構,通過曲線擬合技術得到成分譜帶峰對應于特定結構的基序,但拉曼散射強度和不同振動峰重疊容易受光學系統參數等因素的影響,而且任何一種物質的引入對被測體系會帶來某種程度的污染,進而對分析的結果產生一定的影響。

Susmita等[57]采用拉曼光譜研究了EGCG對HSA纖維化的影響,當與EGCG結合后,螺旋部分隨著無序結構的增加而減少,1340 cm-1處Trp帶的強度增加,表明HSA-EGCG復合物形成后Trp環境的疏水性增加,且纖顫的模式發生改變。Zuzana等[58]采用拉曼光譜法對木犀草素(LUT)與HSA的結合進行了研究,發現結合后蛋白α-螺旋減少和β-轉角結構增加,蛋白質二級結構中許多二硫橋中至少有兩個二硫鍵的構型發生改變,通過對復合物1630～1540 cm-1拉曼光譜范圍進行曲線擬合分析,發現色氨酸在強度和位置上略有改變,與熒光結果一致。謝鳳英等[59]利用拉曼光譜分析蕎麥多酚對米糠蛋白結構的影響,發現蕎麥多酚與米糠蛋白的交互作用可部分破壞米糠蛋白分子間的二硫鍵,降低米糠蛋白分子間的作用,增強米糠蛋白的穩定性。然而Liu等[60]發現在負載白藜蘆醇和姜黃素的納米顆粒的拉曼光譜中未觀察到多酚官能團特征峰,可能是由于最終傳遞系統中多酚的濃度相對較低或者它們與周圍基質發生相互作用。由此可知,拉曼光譜在多酚與蛋白質相互作用的研究中主要用以研究蛋白質的二級結構,但易于受到干擾,影響結果的可靠性。

8 核磁共振波譜

核磁共振波譜法(NMR)是處于強磁場中的原子核自旋對無線電波輻射產生吸收,致使核自旋能級發生躍遷的一種吸收光譜。高分辨率NMR技術在蛋白質、核酸等生物大分子的結構和生物大分子與小分子相互作用研究中的應用已成為化學、生物、醫藥和食品等領域的研究熱點。通過核磁共振波譜法可以精確地識別結合位點,用于結構或性質的關系分析,得到接近生理條件下的多酚-蛋白質復合物構象及動力學(如化學位移、馳豫時間、偶合常數及譜峰強度等參數)等信息,但受溶劑性質的影響且分析復雜,在對蛋白質二級結構研究中具有一定的局限性。

Joshua等[61]用NMR和ITC法測定在生理條件下EGCG對HSA的親和性。NMR顯示兩個結合事件:強結合(n1=1.8±0.2;Kd1=(19±12) μmol/L)和弱結合(n2～20;Kd2=(40±20) mmol/L),這與ITC數據是一致的。Liu等[62]人使用核磁共振波譜顯示GA與α-突觸核蛋白發生瞬時相互作用,蛋白保持大部分展開狀態,主要是N-和C-末端區域中Leu 8,Ser 9,Ser 129和Lys 130四個殘基附近發生局部微妙的構象變化引起暫時地相互作用。Huang等[63]通過NMR研究EGCG對人降鈣素(hCT)原纖化的影響,發現EGCG的芳香環與肽的芳香族側鏈之間的相互作用在抑制hCT的原纖維形成中起重要作用,可以在纖維形成之前阻止hCT的初始締合,有效抑制hCT的原纖維形成。Susana等[64]利用NMR研究唾液蛋白(SP)和單寧之間的相互作用,發現不同單寧與SP相互作用的能力與單寧結構及疏水性相關,同時蛋白結構中某些特定氨基酸如脯氨酸能夠穩定疏水性堆疊也是影響與單寧相互作用的主要因素。核磁共振波譜法是研究多酚與蛋白質相互作用的新方法,可以有效得出多酚-蛋白質復合物構象及動力學信息。

9 展望

目前,對于多酚-蛋白相互作用的研究取得一定的成果,但是多酚與蛋白質之間相互作用的確切機制尚不透徹。首先,分子間相互作用受到諸多因素的影響,要注意體系發生作用的具體環境,需要綜合考慮各種因素對每種方法測定結果的影響程度;其次,選擇的方法不僅能分析結合后蛋白構象的變化,還要關注多酚性質的改變,從多方面研究相互作用機制,合理應用多酚生理功能;再者,每種儀器測定方法對多酚-蛋白相互作用研究都有各自的局限性,應多種測定方法綜合利用,從多方面多角度、理論結合實際對同一反應體系進行研究?？傊?多酚與蛋白之間的相互作用相當復雜,需從宏觀數值和微觀角度進行全面分析,使得結果更精確,以便更好的了解多酚與蛋白作用機制,也為多酚與蛋白質的食品加工提供指導。