食品中維生素B12和葉酸微生物檢測法的研究進展

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(1.廣東產品質量監督檢驗研究院,國家食品質量監督檢驗中心(廣東),廣東佛山 528300; 2.中國水產科學研究院南海水產研究所,廣東省漁業生態環境重點實驗室,廣東廣州 510300)

維生素B12(VB12)和葉酸均屬于B族維生素,它們參與人體重要的生理代謝過程,是一類不可或缺的水溶性維生素。針對VB12和葉酸的特殊功能,為迎合消費者對營養保健食品的需求,市場上越來越多的食品中添加這類維生素,如嬰幼兒配方食品、谷物產品和果汁飲料等,但其是否符合要求有待進一步確證。為了評價食品標簽標注維生素含量的準確性,美國FDA和European Directive 2002/46/EC均制定了一系列檢測食品中標注添加維生素含量的法規[1]。2010年我國也出臺了檢測食品及乳品中VB12和葉酸的國家強制性檢測標準,對其含量的檢測方法、檢出限、適用范圍等都做了明確的規定[2-4]。因此,加強VB12和葉酸檢測技術的研究,對消費者的科學攝入量和監管部門的有效控制添加量具有重要意義。目前,這兩類維生素的檢測技術主要分為微生物法和化學分析法,其中化學分析法很難滿足含量低和基質復雜的食品中的檢測要求,多用于高含量的樣品(如保健品、藥物、復合添加劑等)[5-6],但對于含量低,且低于儀器檢出限的維生素仍然需要微生物法進行測定。目前,本實驗室常規檢測項目是VB12、葉酸、泛酸和生物素,其中泛酸的檢測方法相對比較穩定,生物素的方法可以使用等同效果的檢測試劑盒,只有VB12和葉酸的檢測方法為傳統的微生物法,在實際應用過程中不確定因素較多,不易掌握[7]。針對上述問題,本文對VB12和葉酸這兩種維生素的微生物檢測方法進行歸納總結,以期為將來的檢測提供指導性意見。

1 國家標準中VB12和葉酸的微生物檢測法

我國現有維生素的微生物檢測法依據某種微生物對特定維生素的生長依賴性,在特定條件下,其生長速度與維生素含量成一定的對應關系,從而對維生素進行定量。微生物法測定食品中的維生素源于美國官方分析家協會手冊(Association of Official Analytical Chemists,AOAC),GB 5413.14-2010[2]中檢測VB12和葉酸的微生物法等同采用AOAC的方法,只是格式和適用條件發生一些變化。利用微生物法檢測葉酸是當前技術條件下國際官方機構唯一認可的檢測方法。GB 5009.211-2014[4]食品中葉酸的測定同樣采用的是微生物法。微生物法可靈敏檢測出具有生物活性的維生素,體現的是基質中總維生素的含量,這是儀器分析方法難以做到的。該方法具有成本低、可操作性強、靈敏度高等優點,但同樣存在一定局限性,如耗時長、準確度較低、重復性差等。

2 食品中VB12微生物檢測方法的應用研究

VB12又稱為氰鈷素或鈷胺素,因結合的基團不同,在體內有多種形式存在,以輔酶的形式參加一碳基團的代謝。它是唯一含有金屬離子的水溶性維生素,在維持機體造血功能和健全神經系統功能方面起關鍵作用。VB12微量缺乏會引起心情壓抑和慌亂,嚴重缺乏則易產生疲勞、神經衰弱和老年性癡呆等[8-9],因此,研究VB12微生物檢測方法及技術對科學控制微量VB12在食品中的添加量具有重要的意義。

2.1 嬰幼兒食品和乳品中VB12微生物檢測方法的研究

我國現有的國家標準方法為傳統微生物法,存在操作復雜、檢測周期長、易受外部因素干擾等諸多問題,因此如何優化現有的檢測方法成為研究熱點。魯盛靜等[10]針對GB 5413.14-2010[2]的測定方法,通過對整個實驗過程的關鍵點進行控制,可獲得理想的精密度和重復性,RSD值為0.01%～0.03%(n=5)。針對上述標準的優化,張麗宏等[11]則結合實際經驗,從提取方法、標準曲線制備、防污染措施及菌種保存等幾個方面,對該方法進行補充說明。為確定微生物法檢測奶粉中水溶性維生素的波動性,劉志楠等[12]采取對同一樣品進行大量實驗的方法,最終確定VB12的穩定性和精密度相對較好,RSD和CV值分別為0.05%和5%。測定用菌株是微生物法中至關重要的工具,不同菌株的特異性及其生長特性是決定最終結果重復性和穩定性的重要因素。高星等[13]選用大腸桿菌定量檢測奶粉中的VB12,標準曲線呈拋物線形,VB12含量與菌體生長不成正比,分析可能是奶粉中存在某些抑制菌體生長的因素,但對這種抑制因素以及如何排除它的影響,有待進一步的試驗研究。

為提高微生物法測定VB12的準確性和穩定性,眾多研究學者采用微孔板式微生物法檢測試劑盒測定嬰幼兒配方乳粉中VB12含量,相比傳統方法具有操作簡便、結果準確和重復性好的特點[14-19]。對商品化的試劑盒而言,影響其試驗結果準確性的關鍵因素是標準溶液的保藏與制備,并且只做一個稀釋度的樣品也會對結果準確性造成影響,同時其價格昂貴,增加了檢驗成本。針對這一問題,科研人員把研究方向也轉向基于微生物法的快速檢測方法。劉冬虹等[20]在國家標準方法的基礎上,使用1.2 mL PP小管替代了傳統的試管,通過低溫保存測試菌液,縮小試驗體積,實現縮短檢測周期和簡化操作步驟,提高了結果準確性和重現性,為常規實驗室利用微生物法快速測定VB12提供了參考。余文等[21]通過凍干萊士曼氏乳酸桿菌(Lactobacillusleichmannii)和濃度為5 ng/mL的VB12標準品,96孔板代替傳統培養,酶標儀代替紫外分光光度計,實現了快速檢測。與商品化試劑盒相比,成本更低廉,適用于大批量樣品檢測。王旻[22]通過研究國家標準和德國拜發微生物法測VB12試劑盒,優化前處理過程,減少反應體積,并找出試劑盒標準曲線的實際質量分數,建立了實驗室適用的試劑盒方法。

2.2 其他食品中VB12微生物檢測方法的研究

目前,GB 5413.14-2010[2]中檢測VB12方法的研究對象為嬰幼兒食品和乳品,對于其他食品的檢測方法尚沒有明確規定?；诖?針對其他食品中VB12的檢測方法陸續開展研究,主要以國家標準的方法為研究基礎。微生物法中一個關鍵的步驟就是如何從復雜的基質中提取目標維生素,其對結果的影響占整個實驗誤差的很大部分[23]。因此,提取方法的優化主要基于4個方面:基質的特性;基質中維生素的存在形式(原生形式和添加形式的比重);維生素對pH和熱的穩定性;分析方法的選擇性和特異性。林耀文等[24]在GB 5413.14-2010[2]檢測方法的基礎上,通過優化樣品前處理方式,建立了微生物法測定含乳飲料中VB12含量的方法,檢出限可達0.04 ng/mL,有效解決了含乳飲料中VB12含量低的問題。王志偉等[25]為測定燕麥中的VB12含量,以國家標準方法為參照,對比采用添加淀粉酶的前處理方式,結果發現酶解處理法有更好的適用性。高志斌[26]通過優化微生物檢測方法,測定功能性飲料中VB12的含量,該方法重現性好,靈敏度高,能夠滿足日常檢驗的定量分析。陳亞波等[27]同樣也建立了微生物法檢測維生素飲料中VB12的定量方法,該方法靈敏度和精密度高,測定結果準確可靠。但此方法較難掌握,需嚴格按照要求操作每一步,并盡量保持每次的試驗條件一致,從而保證試驗的重復性及符合精密度要求。蔣孟虹等[28]基于微生物法,建立了腸內營養粉劑中微量VB12含量的測定方法,該方法檢測結果準確、可靠,適用于該類產品中VB12含量的測定。

3 食品中葉酸微生物檢測方法的應用研究

葉酸(又稱為維生素B9)是人體許多生化反應的輔酶。葉酸缺乏可引起細胞性貧血和粒細胞減少,還與新生兒神經管畸形有關,也可導致出生缺陷發生率上升,如唐氏綜合癥、先天性心臟病以及唇腭裂等[29]。孕婦在懷孕期間一般需要補充葉酸,缺乏可引起早產、流產等不良妊娠[30]。

微生物法測定葉酸過程中使用試管進行培養,在大批量檢測時,工作量非常大,96孔酶標板的引用大大提高了工作效率?；矢φ盏萚31]建立了96孔板微生物法微量測定人血漿和紅細胞內葉酸含量的方法,該方法培養基使用量少、檢測時間短、重復性好和檢測樣本量大。同樣是96孔板微生物法,徐文婕等[32]則將甘油冷凍保存乳酸桿菌氯霉素耐藥株與96孔酶標板相結合,極大地縮短了檢測時間,能測定單和多谷氨酸葉酸,靈敏度能達到ng水平,具有較高的重現性。上述兩種方法均可用于其他生物組織和食品中葉酸含量的測定。張慧等[33]通過改進菌株的保存和傳代,優化樣液制備和加樣體積,結合96孔酶標板技術,建立一種高效快速檢測嬰幼兒配方乳粉中葉酸含量的微生物方法。該方法標準曲線相關系數為0.9992,檢出限為2 μg/100 g,檢測周期縮短為2 d。李飛飛等[34]考察了新型維生素檢測試劑盒測定奶粉中葉酸含量的檢測效果,該試劑盒具有較好地準確度、精密度和穩定性,相比國標法操作簡單、結果準確、重復性好。張旺等[35]采用德國IFP微孔板試劑盒檢測嬰幼兒配方奶粉中葉酸質量分數,與GB 5413.16-2010[3]方法相比,降低了菌種在保存、傳代中發生污染和突變的可能性,提高了實驗的可操作性。為了更加精確地計算,該研究還創建了四次方程進行標準曲線的計算。同樣地,唐靚等[36]也曾指出干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)標準管的OD值隨著葉酸濃度增加而增長趨緩,若使用線性方程,求得的葉酸濃度不準確,建議使用4階方程來繪制標準曲線,使計算結果更為精確。蔡雙福等[37]從維生素提取、試劑與標準物質配制、菌株接種等方面對GB 5413.16-2010[3]的測定方法進行改進,使步驟簡化,準確度和重現性與國標法相似。張旭等[38]比較酪乳酸桿菌(Lactobacilluscasei)和糞鏈球菌(Streptococcusfaecalis)測定強化食品中葉酸的含量,經統計學分析,兩種檢測結果的重復性差異不大(p>0.05),實驗結果差異無統計學意義,兩種微生物都是良好的實驗選擇,為用微生物法測定葉酸提供多一種參考。唐靚等[39]將微生物法與高效液相色譜法相比較,發現前者不僅可以測定復雜樣品中的化合物形式的葉酸,而且對于添加劑形式的葉酸與高效液相色譜法具有同樣的準確度,其檢測限可達到0.01 ng/mL。馬景宏等[40]建立了用微生物法測定保健食品中葉酸含量的方法,并對其精密度和準確度進行分析,為國家標準的制訂和該項目的檢驗提供參考。

葉酸的衍生物較多,食品中部分葉酸以與蛋白結合的方式存在,再加上干擾物的影響,使葉酸的測定具有一定困難,因此必需采用合適的樣品前處理方法對葉酸進行降解和提取。曾有學者報道,20個不同實驗室用微生物法檢測大豆、魚粉和早餐麥片中的葉酸含量,其中17個實驗室用酪乳酸桿菌(Lactobacilluscasei),3個實驗室用糞鏈球菌(Streptococcusfaecalis),上述三種產品的變異系數分別為24%、35%和24%,變異范圍如此寬泛主要歸因于葉酸提取的操作不同[41]。王竹[42]則采用微生物法針對不同類食物研究其前處理方法對葉酸檢測結果的影響,發現適宜的前處理方法有助于獲得最大檢出結果。由上可見,樣品前處理在葉酸的檢測分析中是一個既耗時又極易引入誤差的步驟,處理過程是否有效將直接影響分析結果的準確性和可靠性。

4 結論與展望

食品中VB12和葉酸的微生物檢測方法正處于優化和開發創新的階段,一方面不斷研究更加簡便、快捷、干擾小的樣品前處理方法,一方面開發可進一步提高檢測準確性和靈敏度的快速檢測方法,這對規范使用與提升利用率具有較大的促進作用。微生物法作為檢測維生素的經典有效方法,具有其自身的局限性,然而，隨著新技術的不斷發展,該方法已不再是檢測維生素的黃金標準。目前,GB/T 5009.217-2008中采用高效液相色譜法檢測保健食品中的VB12,該方法在檢測一種或多種水溶性維生素時更加快捷、靈敏和準確[43-44]。為拓寬檢測方法的應用范圍,高通量、多組分同時檢測將是維生素檢測的主要發展趨勢。任何檢測方法都存在利弊,針對不同的食品基質,選擇合理的檢測技術,充分發揮該技術的優缺點,有效監控食品中維生素的添加量,對保證消費者的營養全面具有重要意義。