Dot1及其同源物的研究進展

李呈貞(綜述) 韓振格 何東儀(審校)

(1上海市長寧區光華醫院檢驗科 上海 200052; 2上海市中醫藥研究院中西醫結合關節炎研究所 上海 200052)

在低等真核生物中催化H3K79甲基化的賴氨酸甲基轉移酶被稱為Dot1(disruptor of telomeric silencing 1)。在哺乳動物中保守的同源蛋白被稱為Dot1樣蛋白(Dot1-like,DOT1L)。在釀酒酵母、果蠅和人類中,Dot1/DOT1L被認為是催化H3K79甲基化的唯一甲基轉移酶。研究發現DOT1L與染色質沉默、基因表達調控、DNA損傷修復、細胞周期調控、胚胎發育、白血病的發生發展等多種生物學過程有密切的聯系[1],DOT1L已成為針對表觀遺傳修飾因子的重要藥物靶點,本文對Dot1/DOT1L在生理和病理方面的研究進展作一綜述。

Dot1/DOT1L活性及其調控

H3K79甲基轉移酶活性 組蛋白甲基化由一組組蛋白甲基轉移酶催化完成?；谄浯呋Y構域,賴氨酸甲基轉移酶迄今可分為兩類。第1類包含進化上保守的SET結構域,第2類不具備SET結構域,僅包含一個進化上保守的蛋白質DOT1(端粒沉默干擾物)和其同源物。DOT1及其同源物含有與Ⅰ類甲基化酶相似的甲基轉移酶催化結構域[2]。

Dot1是一種進化上相對保守的組蛋白甲基轉移酶。DOT1家族都包含一個4個模體(motif)的保守區域[2]:Ⅰ、post Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。酵母Dot1(yDot1)和人類同源蛋白DOT1L(hDot1L)的晶體結構顯示,它們都擁有一個開放的α/β結構,此結構包含了1個Ⅰ類SAM依賴性甲基轉移酶的典型結構——7股β片段[3-4]。 由于DOT1的結構和精氨酸甲基轉移酶相似[5-6],因此猜測DOT1也能催化精氨酸甲基化。然而,使用逆相高效液相色譜(HPLC)等方法都未能證明DOT1具有精氨酸甲基轉移酶活性[5]。因此,盡管人類和酵母DOT1蛋白在結構上更類似于精氨酸甲基轉移酶,但DOT1家族不能完成精氨酸甲基化修飾。

2002年,幾個小組分別采用不同的方法發現,組蛋白H3的球狀結構域中的第79位賴氨酸即H3K79容易甲基化,而yDot1和hDot1L正是催化這一反應的酶[5,7]。有研究通過選擇性剪切和表達序列標簽分析確定了5個小鼠Dot1 mRNA(mDot1a-mDot1e),其中mDot1a與人類Dot1蛋白(hDot1L)同源性最高,有84%的氨基酸序列相一致,且相似性高達88%,同時研究還證實mDot1a在體內具備特異性催化H3K79甲基化的酶活性[8]。Dot1及其同系物幾乎全權負責H3K79甲基化,在酵母、果蠅和老鼠中敲除Dot1會導致H3K79甲基化完全喪失[5-6,9]。

影響Dot1/DOT1L表達和H3K79甲基化的因素 ENCODE全基因組甲基化測序數據顯示,DOT1L基因啟動子區CpG島在人類各種組織中均呈現極低的DNA甲基化水平,說明其在人類組織中廣泛表達。然而,在小鼠早期胚胎著床前發育時DOT1L mRNA水平呈低轉錄水平[10],在成年后廣泛表達于小鼠器官[8]。提示DOT1L基因的表達受某種特定信號的調節。永生小鼠內髓集合管細胞在暴露于二甲亞砜時DOT1L mRNA水平上調,但轉錄因子上調小鼠DOT1L轉錄的機制還不明確[8]。在小鼠腎集合管細胞DOT1L mRNA的水平受醛固酮抑制[11];在熱帶爪蟾蛻變期間,DOT1L通過T3反應元件(T3 response element,TRE)結合配體甲狀腺受體激活轉錄[12]。

H3K79的1、2、3甲基化(H3K79me1、H3K79me2和H3K79me3)水平與染色質區域、所處細胞周期及發育階段呈動態相關[13]。組蛋白“串擾”影響H3K79甲基化水平。Dot1/DOT1L介導的H3K79的2和3甲基化依賴于H2BK120(哺乳動物)/K123(酵母)和H2BK34的單泛素化[14-18]。H3K79的2和3甲基化需要泛素化H2B和釀酒酵母Dot1富含賴氨酸區域之間的相互作用[19-20]。在泛素化依賴的H3K79的3甲基化的另一機制中,COMPASS復合體或蛋白酶體ATP酶Rpt4和Rpt6連接泛素化的H2B和H3K79[21-22]。在轉錄延伸時,H2BK123單泛素化需要Paf1復合體(與RNA聚合酶Ⅱ延伸相關)參與,進而引起H3K79甲基化[23],而該Paf1復合體的一些組件如Rtf1和Paf1,也與COMPASS和Dot1相互作用[23-24]。另外,DOT1L與磷酸化RNA聚合酶Ⅱ有相互作用,這可能導致了轉錄延伸區域周圍H3K79甲基化[25]。總體而言,轉錄延伸復合物增強了Dot1/DOT1L介導H3K79的2和3甲基化。其他可能原因:泛素化H2B促進染色質結構改變,增加H3K79甲基化的可能性[26]。在釀酒酵母中,另一個影響H3K79me1、H3K79me2和H3K79me3水平的組蛋白“串擾”機制是組蛋白H4的N-端堿性區域和Dot1酸性區域之間的相互作用[27-28]。SIR3和Dot1競爭結合組蛋白H4的堿性區域。K16乙酰化組蛋白H4抑制SIR3與H4的N-端的結合,同時促進Dot1依賴的H3K79甲基化。 此外,在人類細胞中通過過表達H4K16乙?；窼IRT1來降低局部H3K79me2水平,這表明沉默蛋白SIRT1和DOT1L競爭結合組蛋白H4[29]。相反,在錐蟲中H3K76 2或3甲基化不需要組蛋白H4的N-端[30]。

有些基因是保持H3K79甲基化水平的關鍵。在釀酒酵母中,Swi4(調節亞基)和Swi6(DNA結合部分)都是轉錄復合物SCB-結合因子的組成部分,二者均是維持H3K79me2水平所必需的,但在維持H3K79me3水平中并不需要[31]。相比之下,ARD1(N-端乙?；D移酶A復合物的催化亞基)在維持H2B單泛素化和H3K79me3水平中是必需的,而H3K79me2則不需要[32]。

H3K79的非甲基化形式比甲基化形式更加豐富。基于質譜結果,H3K79me1檢測率比H3K79me2高,而H3K79me3在小鼠和人類中很少發現[9,33-34]。特定的去甲基化酶還未發現,甲基化H3K79向去甲基化轉化的機制尚未提出。相反,不同形式H3K79甲基化修飾暗示以下幾種催化過程:首先,Dot1催化1到2、2到3的甲基化需要Bre1依賴性H2BK123泛素化[35-36]。第二,在基因轉錄過程中H3K79me1水平降低的同時,H3K79me2水平則升高,這表明此改變有助于激活轉錄[37]。與此相一致的是,在異染色質形成過程中H3K79me2是降低的[38]。但是甲基化水平與表達水平并不相關,可能是因為在高度轉錄區域轉錄時發生組蛋白替換[39]。由此推測,著絲粒區H3K79me3的積累可能是由于此區域異染色質組蛋白替換緩慢所致[40-41]。第三,H3K79甲基化發生在新結合到核小體的組蛋白以及已存在的組蛋白[34-35]。H3K79甲基化受到細胞分裂過程中組蛋白稀釋的影響,即復制依賴型組蛋白交換解釋了H3K79甲基化的變化[38]。隨著受精,H3K79甲基化的損耗獨立于DNA的合成[41]。最后,在芽殖酵母中90%的H3K79發生甲基化,提示在該生物體內去甲基化酶的活性被高效的甲基化所掩蔽[38,42]。

H3K79甲基化的可逆性 雖然H3K79甲基化的形成特征明顯,并受到多個過程的嚴格調節,但該位點主動去甲基化的過程卻知之甚少。迄今,除H3K79外,其他已知的甲基化修飾的組蛋白賴氨酸殘基都可以被至少一種組蛋白去甲基化酶去甲基化[2]。一系列證據表明H3K79甲基化可能是可逆的,因為它受動態調節。首先,在酵母和人類細胞中,H3K79me2水平隨細胞周期而波動[7,31]。其次,在小鼠和果蠅早期胚胎發育期間H3K79me2是去甲基化的,這表明非活性去甲基化酶可能存在于成熟卵母細胞中[6,41]。再次,二羥戊二酸(2-HG)對α-酮戊二酸(α-KG,雙加氧酶的輔因子)的拮抗作用表明合成2-HG和突變異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)存在使H3K79me2的整體水平升高,其中IDH是催化異檸檬酸氧化脫羧為α-KG的NADP依賴酶[43]。這些結果表明雙加氧酶可能催化體內H3K79me2去甲基化,下調H3K79me2水平。因此,亟需尋找到H3K79特異性去甲基化酶。

Dot1在細胞周期調節中的作用細胞周期是單向的不可逆過程,以確保正常的細胞分裂。研究發現,H3K79me1、H3K79me2和H3K79me3水平與染色質區域、所處細胞周期及發育階段呈動態相關,表明其在細胞周期調控中發揮作用[13]。

在哺乳動物中,DOT1L甲基化H3K79被認為是在G1/S轉換期調節細胞周期進程的關鍵因素。老年大鼠肺組織的H3K79me3水平較年輕大鼠肺組織低;因此,低甲基化H3K79可能是與衰老(細胞周期不可逆轉阻滯于G0/G1期)相關的組蛋白標記[44]。然而,與老年大鼠肺組織H3K79低甲基化相反的是,H3K79me1和H3K79me2在快速老化小鼠(SAMP)的大腦中是上調的[45]。一種解釋是,H3K79甲基化程度對衰老的影響取決于不同的有機體,或者H3K79甲基化水平在SAMP中升高可能是衰老模型的結果。

小鼠DOT1L也參與分化胚胎干細胞(embryonic stem cell,ESC)和紅系祖細胞的細胞周期過程。雖然DOT1L缺失的ESC仍保持增殖和多能性的能力,但在體外分化中顯示出嚴重的增殖缺陷,導致在G2/M期累積。有趣的是,DOT1L敲除的未分化和分化ESC都顯示出非整倍性,而表型則是在分化時變化更明顯[46]。另外,在DOT1L敲除的ESC中可以觀察到細胞凋亡[9],但在敲低細胞中未見[46]。與ESC相反,在紅系祖細胞中敲除DOT1L能觀察到的結果是G0/G1期累積,而非G2/M期[47],這表明DOT1L對細胞周期的影響可能具有細胞特異性。

然而,在細胞周期中H3K79甲基化的變化在進化上不是保守的,H3K79甲基化調控的相關功能也不是保守的。Dot1/DOT1L介導的H3K79甲基化在細胞增殖中的作用具有物種或組織特異性。在芽殖酵母、錐蟲、小鼠ESC和人癌細胞中,Dot1/DOT1L缺失或沉默會導致細胞增殖的降低,而心臟特異性DOT1L的缺失會導致心臟組織增殖。因此,Dot1/DOT1L在不同類型細胞中對增殖功能的影響還需要有針對性的進一步研究。

Dot1在發育過程中的作用研究顯示mDot1廣泛表達于各組織中,如肝、腎、肺、心、腦、腸及卵巢等組織,另外研究發現在兩細胞階段的胚胎,甚至在體外19.5天的受精卵中均發現mDot1的存在[8],這表明mDot1存在于不同的發育階段,有可能在細胞生長和分化中發揮著重要作用。目前針對Dot1和H3K79甲基化的研究在多種組織及細胞中取得了巨大的進步。

Dot1在心臟功能中的作用 在mDOT1L敲除的胚胎中觀察到心血管發育缺陷,提示mDOT1L可能在心臟發育中起作用[9],這與離體研究心肌生成觀察到的H3K79甲基化增加能誘導心血管標志物基因表達相一致[48]。此外,在小鼠心肌中特異敲除mDOT1L可引起擴張型心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)[49],這是一種心肌疾病,臨床表現為心腔擴張和收縮功能障礙。mDOT1L介導的H3K79甲基化直接調節抗肌萎縮蛋白的轉錄[2]。鑒于抗肌萎縮蛋白參與構成抗肌萎縮蛋白-糖蛋白復合物(dystrophin-glycoprotein complex,DGC),而DGC參與信號轉導和心臟收縮期間緩解機械應力,因此抗肌萎縮蛋白表達下調能引起DGC不穩定,進而導致肌膜損傷?？辜∥s蛋白基因突變是人類DCM和肌營養不良癥的病因。在mDOT1L心肌特異性基因敲除小鼠中觀察到的DCM現象,可通過異位表達抗肌萎縮蛋白的截斷功能域得以補救[49],這表明抗肌萎縮蛋白是DOT1L介導心臟功能的主要下游靶標。與正常心臟組織相比,人類原發性DCM心臟組織中DOT1L表達水平顯著下降[49],提示DOT1L失調可能是人類DCM發病的因素之一。

Dot1在紅細胞生成中的作用 DOT1L敲除的胚胎在10.5天表現出嚴重的貧血,說明胎兒紅細胞生成受到損害[47]。mDOT1L在紅細胞生成中的作用可能與先前報道的H3K79甲基化在紅系特異性β-珠蛋白周圍富集有關[50]。為此,卵黃囊衍生的造血細胞中mDOT1L的不足能引起G0/G1細胞周期阻滯,而且在體外生長刺激物存在時使培養的紅系祖細胞凋亡,但對骨髓系的生長和分化沒有影響[47]。RT-qPCR和CHIP分析表明,mDOT1L通過激活GATA2發揮其在紅細胞生成中的作用。DOT1L缺陷的造血細胞下調GATA2,引起髓系轉錄因子PU.1去阻遏,從而阻止紅細胞分化[47]。

Dot1在骨關節中的作用 髖關節骨性關節炎(osteoarthritis,OA)是最常見的引起疼痛和殘疾的關節疾病。OA發病有多方面的原因,其中包括顯著遺傳傾向[51]。關節間隙寬度(joint space width,JSW)是關節內軟骨厚度的參照物,因此最小JSW(mJSW)是在臨床試驗和流行病學中研究膝關節和髖關節骨關節炎的主要參數。通過全基因組關聯研究(GWAS)分析發現染色體19p13.3上的rs12982744多態性與OA的JSW有關,而此SNP位于DOT1L基因上,提示DOT1L可能與OA發病有關[52-53]。最近發現DOT1L是腸道Wnt基因激活必不可少的特異酶,DOT1L也是果蠅體內控制高水平Wnt信號通路下游基因表達所需的酶[54]。而Wnt信號在軟骨和骨形成及滑膜關節發育中起著關鍵作用[55]。Wnt突變在生命早期能引起發育畦性(WNT3突變)。研究發現[52],沉默DOT1L在體外可抑制軟骨生成;在ADTC5細胞(軟骨細胞系)中敲除DOT1L會降低軟骨分化,并降低軟骨生成過程中蛋白多糖和膠原含量及礦化作用,同時Wnt靶基因的表達也有明顯的降低。此外,在ATDC5軟骨模型系統中DOT1L與TCF和Wnt信號交互作用[52]。這些發現表明,DOT1L通過調節Wnt靶基因的轉錄影響軟骨細胞分化,進而參與OA發病過程。這使得DOT1L成為干預髖關節骨關節炎的潛在治療靶點,已開發小分子抑制劑并啟動Ⅰ期臨床試驗[53]。

通過調節DOT1L的活動來控制DOT1L依賴性疾病DOT1L缺陷抑制正常細胞周期進程,因環境和物種的不同最終導致異常增殖,包括G1期停滯、有絲分裂停滯、衰老、非整倍體和細胞凋亡。 在人體敲除或沉默DOT1L能防止癌細胞擴散。DOT1L缺陷型肺癌細胞會走向衰老,這可能是一種用來消除增殖活躍癌細胞的方法[44]。DOT1L下調也能導致LS174T結腸癌細胞的死亡,但HEK293T 細胞卻不會死亡[56]?；旌献V系白血病(mixed lineage leukemia,MLL)融合蛋白誘導的轉化細胞局部會有H3K79甲基化,但沒有DOT1L的情況下會發生G1期停滯或凋亡[57]。特異的DOT1L抑制劑(如EPZ004777)能使MLL融合蛋白誘導的白血病細胞發生細胞凋亡[58]。相反,致白血病融合蛋白CALM-AF10能使DOT1L從染色質解離并降低H3K79me2總體水平[33]?？傊?下調DOT1L是一個潛在的癌癥治療策略,因為DOT1L的缺失能抑制癌細胞的增殖。

盡管如此,靶向DOT1L可能對正常細胞是有害的,DOT1L介導的H3K79甲基化在發育、造血和維護器官功能方面有重要作用,提示臨床應用DOT1L抑制劑一定要慎重考慮。 Daigle等[58]用DOT1L抑制劑EPZ004777治療能殺死MLL重排型白血病細胞,但對非MLL重排型白血病細胞或造血干細胞無影響。這種差異提供了MLL融合白血病有效的治療手段,但在其他實體瘤中需對其控制細胞增殖的能力進行評估。