白花蛇舌草對膀胱癌EJ細胞株的增殖抑制作用及其機制

南錫浩 于峰 田河 馬瑞 張智慧 張月順

[摘要] 目的 探討分析白花蛇舌草的提取物在膀胱癌EJ細胞株增殖抑制中發揮的作用及其機制。方法 將2016年5月—2017年5月培養的的膀胱癌EJ細胞株按照隨機數字法分為對照組和研究組，對照組不加任何物質，研究組的細胞株加入白花蛇舌草的提取物，利用MTT法測定細胞的增殖抑制作用，并利用流式細胞儀檢測膀胱癌EJ細胞株的端粒酶含量，觀察對比兩組細胞株的生長抑制率以及端粒酶的含量。 結果 研究組的EJ細胞株加入白花蛇舌草提取物12、24、48、72 h的生長抑制率分別為（7.38±0.49）、（11.94±0.78）、（18.46±0.24）、（28.76±0.57），均明顯高于對照組的（5.14±0.38）、（7.96±0.98）、（12.64±0.37）、（15.79±0.76）（P<0.05）；而研究組細胞株12、24、48、72 h的端粒酶含量分別為（33.13±1.84）、（25.46±2.79）、（15.34±2.13）、（9.54±1.79），均明顯低于對照組的（37.16±2.31）、（31.91±2.78）、（18.49±1.4）、（12.48±2.07）（P<0.05）。結論 白花蛇舌草中的提取物應用于膀胱癌EJ細胞中能夠有效抑制細胞的增殖作用，作用機制與端粒酶的含量有關，是一種抗腫瘤的新型藥物，在臨床上值得進一步推廣應用，有巨大的參考價值。

[關鍵詞] 白花蛇舌草；膀胱癌EJ細胞株；抑制增殖；端粒酶

[中圖分類號] R5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2018）01（a）-0001-03

Inhibitory Effect of Hedyotis Diffusa on Proliferation of Bladder Cancer Cell Line EJ and Its Mechanism

NAN Xi-hao1， YU Feng1， TIAN He1， MA Rui1， ZHANG Zhi-hui1， ZHANG Yue-shun2

1.Department of Urology， Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical College， Mudanjiang， Heilongjiang Province， 157011 China； 2.Department of Anesthesiology， Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical College， Mudanjiang， Heilongjiang Province， 157011 China

[Abstract] Objective This paper tries to investigate the role and mechanism of extract of Hedyotis diffusa in inhibiting the proliferation of bladder cancer EJ cell line. Methods The bladder cancer EJ cell lines cultured from May 2016 to May 2017 in experimental operation were divided into control group and study group according to random number method， control group without any material， the team of cell lines to join the spreading hedyotis herb extract， determination of cell proliferation inhibition by the MTT method， and by using flow cytometry instrument to detect the contents of bladder cancer EJ cell lines of telomerase， observation compared two groups of cell lines growth inhibition rate and the content of telomerase. Results The growth inhibition rate of EJ cell line added to the extract of Hedyotis diffusa were （7.38±0.49），（11.94±0.78）， （18.46±0.24） and （28.76±0.57） at 12， 24， 48 and 72 h， respectively， which were significantly higher than that of the control group （5.14±0.38）， （7.96±0.98）， （12.64±0.37）， （15.79±0.76） （P<0.05）， while the telomerase contents in the study group at 12， 24， 48 and 72 h were （33.13±1.84） （25.46±2.79）and （15.34±2.13），（9.54±1.79）were significantly lower than the control group （37.16±2.31）， （31.91±2.78）， （18.49±1.49）， （12.48±2.07） （P<0.05）. Conclusion Of spreading hedyotis herb extract used in bladder cancer EJ cells can effectively inhibits the proliferation of cells， the mechanism of action is associated with the levels of telomerase， is a new type of antitumor drug， worthy of further popularization and application in clinic， has great reference value.

[Key words] Hedyotis diffusa； Bladder cancer EJ cell line； Inhibition of proliferation； Telomerase

膀胱癌通常是發生在膀胱黏膜上的惡性腫瘤，也是泌尿系統中最為高發多見的疾病，膀胱癌在任何年齡都有發病的可能，發病率近年來隨著年齡的增長呈逐漸升高的趨勢，而且男性膀胱癌發病率大約為女性的3～4倍，膀胱癌患者的臨床表現是無痛性、肉眼可見、間歇性血尿，出現排尿困難，嚴重影響患者的生活質量[1]。膀胱癌屬于移行細胞癌，手術后患者會在很短時間內再次復發，并且有病情加重的危險，該疾病應用手術治療不能獲得滿意的療效，所以一般會采用化療輔助治療膀胱癌，常用化療藥物為絲裂霉素、吡柔比星、卡介苗等，但是化療藥物在殺死腫瘤細胞的過程中也會殺傷正常細胞，給患者帶來嚴重的不良反應。白花蛇舌草藥味偏苦、淡，性寒，有著清熱解毒、利尿除濕、消痛散結的良好功效，善于治療各種炎癥?，F代藥理實驗研究表明，白花蛇舌草提取物通過激活T細胞，釋放大量的干擾素，從而抑制腫瘤細胞的增殖作用，除此之外，白花蛇舌草提取物還能夠增強機體的細胞免疫和體液免疫功能，能夠促使機體增強防御功能。該研究選取2016年5月—2017年5月培養的的膀胱癌EJ細胞株，旨在探討分析白花蛇舌草提取物在膀胱癌EJ細胞株增殖抑制中發揮的作用及其機制，從而為膀胱癌的治療提供參考，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 實驗材料 細胞來源為人膀胱癌EJ細胞株、從中藥房購買白花蛇舌草，將藥草浸泡后煮沸一段時間，過濾后將提取液濃縮后配比加入乙酸乙酯和乙醇，來回抽濾后獲得純度較高的提取物，然后放入冰箱待用[2]。

1.1.2 實驗儀器 CO2恒溫電熱培養箱、超凈工作臺、低速離心機、細胞培養瓶、流式細胞儀、倒置顯微鏡、旋轉蒸發儀、微孔濾器、低溫冰箱、振蕩器。

1.1.3 實驗試劑 RPMI1640培養基、新生牛血清、二甲基亞砜（DMSO）、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、單克隆抗體等。

1.1.4 利用隨機數字法 將膀胱癌EJ細胞株分為對照組和研究組，在實驗前進行同步培養，使其生長的環境完全相同[3]。該實驗符合細胞相關實驗的規定，兩組細胞株的一般資料對比差異無統計學意義（P>0.05）。

1.2 方法

1.2.1 細胞實驗 先培養對照組和研究組的細胞株，膀胱癌EJ細胞株是單層細胞，并且貼壁生長，將細胞株在含有胎牛血清、鏈霉素、青霉素的RPMI1640培養基中培養，并將培養瓶放入CO2恒溫電熱培養箱，培養至細胞的指數生長期時進行實驗。對照組細胞株中不需要加入任何物質，只需每日更換培養液，隔一天對細胞進行傳代，而研究組的細胞株接種培養到一定階段時，加入白花蛇舌草提取物，繼續放入細胞培養箱中培養，待細胞進入指數生長期后進行實驗[4]。

1.2.2 細胞毒性實驗 用MTT法測定白花蛇舌草提取物對于腫瘤細胞的增殖抑制作用，首先取指數生長期EJ細胞株用胰酶消化后接種于96孔細胞板上，在CO？恒溫電熱培養箱中培養24 h，吸棄原培養液后加入胎牛血清培養，一段時間后每孔加入MTT25 μL，繼續孵育4 h，再將上清液棄去，每孔再加入100 μL二甲基甲砜，利用振蕩儀使結晶物溶解充分，最后用聯免疫檢測儀測出兩組細胞的吸光度A值[5]。細胞抑制率=（1-研究組A值/對照組A值）×100%。

1.2.3 定量檢測兩組細胞株的端粒酶含量 將對照組和研究組的膀胱癌EJ細胞株中加入單克隆抗體，并在CO？恒溫電熱培養箱中孵育30 min，去上清后，放入冰箱中保存24 h后，利用儀器檢測端粒酶的含量[6]。

1.3 觀察指標

計算兩組膀胱癌EJ細胞株的細胞抑制生長率，細胞抑制率由MTT法檢測出的細胞吸光度代入公式得出。此外用流式細胞儀測出兩組膀胱癌EJ細胞株的端粒酶含量，比較分析實驗結果。

1.4 統計方法

數據應用SPSS 18.0統計學軟件進行分析，計量資料采用（x±s）表示，進行t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

研究組細胞株的腫瘤細胞生長抑制率明顯高于對照組（P<0.05），見表1。

研究組細胞株的端粒酶含量顯著低于對照組（P<0.05），見表2。

3 討論

膀胱癌屬于移行細胞癌，是泌尿系統常見高發的惡性腫瘤，具有發病率高、致死率高、復發率高的特點，癌細胞呈浸潤性生長，且男性發病率遠高于女性，臨床上對于膀胱癌的治療方式仍以手術、化療為主，化療的常用藥物為絲裂霉素、阿霉素、干擾素、吡柔比星、卡介苗等，但是這些治療手段僅能暫時延長患者的壽命，一段時間后仍會復發而且有加重病情的危險，這些抗癌藥物都是通過一級動力學原理來殺滅腫瘤細胞，阻斷腫瘤細胞的增殖生長，誘導細胞凋亡，從而達到治愈疾病的目的[7]。但是腫瘤細胞的繁殖率相當高，殘存的細胞成為誘發癌癥復發的主要原因，所以說尋找具有高誘發癌細胞凋亡，遏制細胞生長繁殖的高效抗腫瘤藥物在臨床治療中有著重要的意義，能夠有效預防疾病的發展。

白花蛇舌草中藥味偏苦，偏淡，屬于性寒植物，具有清熱解毒、利尿除濕的功效，常用于治療各種炎癥[8-9]。該研究將白花蛇舌草提取物加入研究組，對照組不加任何物質進行細胞毒性實驗以及端粒酶含量的測定，觀察兩組細胞株對于膀胱癌腫瘤細胞的抑制作用及其作用機制， 數據顯示72 h后研究組的腫瘤細胞生長抑制率為（28.76±0.57），顯著高于對照組的抑制率（15.79±0.76）（P<0.05）；72 h后研究組的端粒酶含量為（9.54±1.79），顯著低于對照組的（12.48±2.07）（P<0.05）。中國老年學雜志發表的《白花蛇舌草對膀胱癌EJ細胞株的增殖抑制作用及其機制》中也做過類似的實驗，選擇不同濃度的白花蛇舌草提取物分不同的時間段作用于膀胱癌EJ細胞株，72 h后1.5 μg/L的腫瘤細胞抑制率達到峰值（53.24±4.03），流式細胞儀檢測加藥后對照組端粒酶含量為（42.465±3.987），實驗組0.5、1、1.2、1.5 μg/L組端粒酶含量分別為（33.580±1.842）、（25.710±3.222）、（15.334±2.555）、（9.118±1.874）。與該實驗不同的是沒有分對照組和研究組，只選取不同濃度的白花蛇舌草提取物進行研究對比，但是都說明了隨著時間的推移以及濃度的增加，白花蛇舌草在腫瘤細胞增殖抑制中發揮的作用越來越強，端粒酶的含量也在顯著下降。

研究發現，白花蛇舌草提取物抑制腫瘤細胞生長繁殖的作用機制是通過減少端粒酶含量來實現的，端粒是由真核細胞染色體內一段重復串聯的DNA序列和相應的蛋白質組成的，在細胞分裂增殖時，端粒的末端會逐漸縮短，它的功能是維持染色體的恒定，隨著細胞的復制，端?？s短到一定程度時無法行使它的功能，最終誘導癌細胞停止增值死亡[10]。而端粒酶是一種核糖蛋白酶，補充作用于逐漸縮短的染色體末端，所以說腫瘤的惡化程度越高，端粒酶活性越高，含量越多。實驗中通過用流式細胞儀測定兩組細胞株的端粒酶含量，可以分析得到白花蛇舌草提取物抗腫瘤、抑制癌細胞生長繁殖的作用。

綜上所述，通過細胞毒性實驗MTT法以及流式細胞儀的測定，充分證明白花蛇舌草提取物對于腫瘤細胞的生長抑制、減少端粒酶數量、降低端粒酶活性都發揮著重要的作用，為臨床上治療膀胱癌提供了參考，臨床上應當進一步推廣應用。

[參考文獻]

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（收稿日期：2017-10-08）