細胞外囊泡與紅細胞生成及相關制品的研究進展

孫士鵬 安成 劉貴建 吳志奎

細胞分泌的細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）包括外泌體（exosomes）、外體（ectosomes）、微泡（microvesicles）、微粒（microparticles）、凋亡小體（apoptotic bodies）等成分［1］。這些細胞分泌的EVs存在很大的異質性，目前依據(jù)透射電鏡、免疫電鏡和其他生物化學的方法，可把EVs主要分為外泌體和微泡2大類［2］。外泌體是多種活細胞晚期內體分泌的30～100 nm的小囊泡體，在蔗糖密度梯度溶液中密度范圍為1.13～1.19 g/mL［3］。EVs的主要功能是作為蛋白質、脂質和RNAs的遞送載體，介導體內不同細胞類型之間的細胞間通訊，從而影響正常和病理狀態(tài)。最初外泌體的發(fā)現(xiàn)源于紅細胞成熟，外泌體與紅系分化關系極為密切。EVs及其攜帶的miRNA等分子的功能研究主要集中在紅細胞發(fā)育分化成熟的調控以及臨床用紅細胞制品領域，本文就紅細胞生成和紅細胞制品的相關EVs研究進展進行論述，以期為紅細胞疾病的相關機制研究以及疾病治療提供新的思路。

1 細胞外囊泡的定義及其發(fā)現(xiàn)

1.1 細胞外囊泡的定義及生成

EVs是在多囊泡胞內體（multivesicular endosome，MVE）成熟過程中，由內體膜通過內出芽形成的管腔內囊泡，隨后通過MVE與細胞膜融合的方式釋放到細胞外［4］。EVs廣泛存在于精液、血液、尿液、唾液、母乳、羊水、腹水液和腦脊液等體液中［5］。迄今為止，文獻報道包括樹突狀細胞、肥大細胞、T細胞、B細胞、表皮細胞、間充質干細胞、神經(jīng)元細胞和許多腫瘤細胞等在內的幾乎所有的細胞都能分泌外泌體［1］。EVs形成和排出細胞的過程中主要依靠4種內體分選復合物（ESCRT0，I，II，III）把細胞內含物、跨膜蛋白以及膜周邊蛋白質摻入到外泌體中［6］。作為EVs的主要存在形式，外泌體也可以以ESCRT非依賴的方式形成，四跨膜蛋白CD63、CD81、CD9也直接參與各種“貨物”向外泌體的分選［7］。

1.2 細胞外囊泡的發(fā)現(xiàn)源于紅細胞成熟

紅細胞是血液中數(shù)量最多的一種血細胞，主要功能是在脊椎動物體內運送氧氣的最主要的媒介，同時還具有免疫功能。EVs發(fā)現(xiàn)源于紅細胞成熟，隨著EVs研究的火熱化，其在紅系分化中的作用也被逐步揭示出來。20世紀80年代研究人員陸續(xù)發(fā)現(xiàn)大鼠網(wǎng)織紅細胞、綿羊紅細胞等分泌小囊泡，并定義了外泌體，即起源于網(wǎng)織紅細胞成熟時細胞外部膜囊泡。外泌體曾一度被視為是紅細胞成熟時去除的胞內廢棄物。直到20世紀末才發(fā)現(xiàn)B細胞分泌的外泌體能夠攜帶并運輸功能性的抗原提呈復合物，提出外泌體可能是免疫系統(tǒng)的細胞之間的通信運載體［8-9］。可見外泌體與紅細胞的研究有很深的淵源，科學界對其功能認知也經(jīng)歷了否定之否定的過程。

2 細胞外囊泡的功能研究進展

幾乎所有細胞都能分泌EVs［1］，在多種體液中存在的EVs通過將核酸和蛋白質轉移到靶細胞和組織中，在細胞-細胞通訊中起關鍵作用。外泌體攜帶多種蛋白質、脂質和RNAs，目前外泌體結構和功能數(shù)據(jù)庫ExoCarta（http：//exocarta.org/）數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)鑒定出外泌體含有9 769種蛋白、3 408種mRNA和2 838種miRNA。不同的細胞來源EVs，通常攜帶有獨特的貨物如miRNA或整合素，因而可作為相關疾病的分子標記物。多用于腫瘤診斷以確定特異性癌癥亞型，例如膠質母細胞瘤患者血清外泌體包含特征性EGFRvⅢ突變體基因mRNA和miRNA可能作為疾病診斷的標志物［10］。EVs尤其是外泌體介導體內不同細胞類型如腫瘤細胞、成纖維細胞、內皮細胞、白細胞等細胞之間的通訊，因而在炎癥反應、腫瘤血管生成、組織炎癥、免疫重建、腫瘤免疫治療等方面發(fā)揮重要作用［11-12］。例如EVs能在未來轉移部位與腫瘤微環(huán)境中的基質細胞相互作用，以促進擴散的腫瘤細胞的存活和生長，并增加腫瘤細胞侵襲性［10］。

3 紅細胞中的細胞外囊泡

3.1 紅細胞成熟過程中的細胞外囊泡研究

紅系分化從造血干細胞開始，逐漸失去分化潛能，經(jīng)歷早期紅系集落生成細胞（burst-forming unit-erythroid，BFU-E）和紅細胞系集落形成單位（colony-forming unit-erythroid，CFU-E）最終脫核和變形成為有功能的成熟紅細胞。造血前體細胞主要存在于骨髓中，少量釋放到外周血中。成熟紅細胞中含有血紅蛋白但是沒有細胞核和線粒體，因而成熟紅細胞內沒有DNA僅有少量殘存的RNA。HBB是血紅蛋白β亞基的編碼基因，HBBmRNA不會在成熟紅細胞內大量存在。Jun等［13］在外周血外泌體中可以檢測大量HBBmRNA，此結果說明含有大量HBBmRNA的外泌體應該是來自骨髓紅系前體細胞釋放到外周血中，而不可能來源于外周血成熟紅細胞。這些含有大量HBBmRNA的外泌體是骨髓前體紅細胞代謝的廢物，還是主動釋放到外周血中由紅細胞等攝取而發(fā)揮特定的功能尚未被揭示。

成熟紅細胞和紅系前體細胞膜蛋白存在差異，這些差異蛋白的表達也與外泌體關系密切。紅細胞在成熟過程中有一些不再需要的膜蛋白質可以通過外泌體排除途徑釋放出紅細胞，致使成熟紅細胞表面此蛋白減少或缺失。例如：大部分成熟紅細胞的轉鐵蛋白受體（Transferrinreceptor，TfR）作為管腔內囊泡的貨物通過MVE和隨后的外泌體釋放出來，其機制是基于細胞膜脂處理系統(tǒng)來調控膜蛋白的分選［14］。此外乙酰膽堿酯酶和整合素α4β1也可以通過外泌體排除途徑釋放出紅細胞，從而使細胞表面這些蛋白質減少或消失［15］。網(wǎng)織紅細胞上整合素α4β1的存在會導致某些疾病的血液循環(huán)并發(fā)癥，因而通過外泌體清除紅細胞上的整合素α4β1非常重要。整合素α 4β1在造血祖細胞上表達，隨著紅系分化成熟細胞含量逐漸下調。外泌體上整合素α4β1能夠與內皮細胞上的血管細胞粘附分子1（VACM-1）結合，可能參與了其他重要的功能。相反，部分膜蛋白則只存在于成熟紅細胞膜而外泌體膜上沒有表達或含量很低。例如：B-spectrin蛋白在網(wǎng)織紅細胞成熟時不會從細胞膜上丟失，在網(wǎng)織紅細胞外泌體上檢測不到B-spectrin蛋白［16］。血型糖蛋白A（GPA）在紅系來源的外泌體上的分布也遠低于紅細胞。還有一些蛋白在成熟紅細胞和紅細胞來源的外泌體上均有表達。ABCB6是ATP轉運蛋白家族的成員之一，被認為是負責線粒體攝取卟啉的蛋白。Katalin等人［17］發(fā)現(xiàn)ABCB6既存在于成熟紅細胞上，在紅細胞成熟的最后步驟從網(wǎng)織紅細胞釋放的外泌體上也有表達，但是其功能還有待揭示。相比紅細胞的質膜來說，紅細胞來源的外泌體膜中二酰基甘油（DAG）、膽固醇、補體受體1（CR1，CD35）和GPI錨定蛋白如CD55、CD59以及乙酰膽堿酯酶相對含量較高［18］。這些紅細胞來源的外泌體是否還發(fā)揮著重要的生理功能？還是作為代謝廢物經(jīng)過腎臟通過尿液排出體外？近期的一項針對鐮形紅細胞貧血的研究提示這些外泌體可能仍是具有功能性作用的。研究發(fā)現(xiàn)鐮形紅細胞貧血患兒血漿外泌體主要來源于紅細胞，其含量遠高于健康對照組［19］。鐮形紅細胞貧血患者的EVs能顯著增加單核細胞與內皮細胞的粘附功能、促進內皮細胞P-選擇素高表達，而且病情嚴重的鐮形紅細胞貧血患兒的EVs增加單核細胞粘附功能最強。紅細胞來源外泌體的功能還需要進一步的關注和研究。

當前對EVs及其裝載物的功能研究主要集中在miRNA領域，紅細胞相關EVs的miRNA研究也取得了一定的進展。雖然成熟紅細胞內僅殘留部分RNA，但是這些RNA包含了多種miRNA。Simonas等［20］使用磁珠分選系統(tǒng)從人外周血分離獲得CD235a+的紅細胞，提取RNA經(jīng)過Illumina HiSeq 2500測序鑒定出271種已知miRNA，而且每個樣本大多數(shù)miRNA的平均reads讀數(shù)＞1 000 reads。這說明成熟紅細胞分泌的外泌體中應該裝載有miRNA，但是當前紅細胞相關外泌體內非編碼RNA功能研究較少，功能還有待揭示。miR-486是氧化應激的急相反應miRNA，在紅系分化過程中發(fā)揮非常重要的作用［21］，研究發(fā)現(xiàn)外泌體來源的miR-486可以靶向人紅系白血病TF-1細胞內SIRT1蛋白促進細胞向紅系分化、增殖［22］。外泌體來源的miR-486等理論上能夠直接參與紅系分化和氧化應激反應，在紅細胞生成障礙、貧血等生物學過程中發(fā)揮的作用還需要進一步研究。

3.2 紅細胞儲存過程中細胞外囊泡的研究

當前紅細胞相關EVs的研究較多的集中在紅細胞制品領域。在血液儲存過程中，紅細胞經(jīng)歷新陳代謝和生化反應都會顯著影響紅細胞膜的完整性、變形性和攜氧能力。由于輸血成分的變化可能會導致組織缺氧或者炎癥反應，進而降低輸血后受者存活率。雖然為了確保血液制品的安全性，在濃縮紅細胞制品（red blood cell concentrate，RCC）的加工和儲存中應用了監(jiān)管標準，但許多產(chǎn)品質量特性受到制造方法和低溫保存的影響。目前，存儲持續(xù)時間對血液制品質量和輸血結果的作用一直是研究的焦點。血液中的EVs是輸血后炎癥和凝血的潛在影響因素，在RCC的存儲過程中EV的異質性可以作為紅細胞損傷的指示器［23］。研究者們［23］通過使用流式細胞術分析和可調電阻脈沖傳感設備進行定量研究，在RCC產(chǎn)品中觀察到EV亞群和濃度以及細胞質量參數(shù)的差異顯著，隨著低溫貯存期延長，RCC的EVs的數(shù)量增加。

研究發(fā)現(xiàn)隨著紅細胞EVs的釋放，造成存儲紅細胞膜漸進性和顯著的補體調節(jié)因子（如CR1、CD55和CD59）的顯著缺失，這些EVs具有潛在的輸血相關免疫調節(jié)作用［24］。除了逐漸失去補體調節(jié)作用，儲存的紅細胞CR1功能損失導致儲存的紅細胞結合和清除補體調理的能力穩(wěn)步下降。雖然靜息的中性粒細胞比紅細胞表面的CR1表達量高出200～300倍，但是紅細胞CR1免疫復合物的親和力較中性粒細胞（PMN）CR1強，所以調理顆粒優(yōu)先結合到紅細胞CR1上［25］。臨床上常用的紅細胞制品的儲存時間在很大程度上影響了其釋放的外泌體等胞外囊泡的大小和濃度［26］。因而紅細胞制品相關EVs的研究對輸血相關免疫調節(jié)作用極為重要。因而，輸血相關EVs的研究報道目前還很少。

4 小結及展望

健康個體持續(xù)每秒合成約200萬的紅細胞替代衰老的紅細胞。這個新舊更替過程必須被嚴格控制以保證紅細胞數(shù)量能夠維持在一個很小的生理范圍內。EVs是多種活細胞晚期內體分泌的小囊泡體，主要功能是作為蛋白質、脂質和核酸等分子的運送載體。相對EVs在腫瘤和炎癥等領域取得的成果來說，紅系分化和紅細胞制品相關的外泌體研究雖然有所進展，但是仍然進展緩慢。當前EVs的研究主要受到分離純度和費用的限制，降低分離純度成本并提高純度是亟待解決的主要問題。在分離純度方面，差速離心法結合超高速離心法仍是金標準的方法，可以獲得人外周血EVs包括外泌體、外體、微泡、微粒、凋亡小體等成分，如何對這些異質性的EVs進行研究？是通過物理化學的方法對不同大小的EVs進行分門別類的研究，還是對同種細胞來源的EVs進行研究？科技進步需要更加細致和精密的研究，在當前科技水平條件下，筆者傾向于后者。對于某類細胞來源的EVs（例如紅細胞來源的EVs）的分離純化需要用到特定細胞表面標記分子的相應抗體標記的磁珠，用于研究或者診斷的費用則大為增加，我們期待技術的革新和進步。

EVs及其運送的小分子功能涉及到表觀遺傳修飾、相關轉錄因子和基因的表達調控等，在紅系細胞的分化和發(fā)育及成熟過程中起到關鍵作用。在紅系細胞的分化和發(fā)育及成熟過程中會釋放大量的EVs到外周血當中，但是相關的EVs的功能研究依然很少。由于遺傳、營養(yǎng)以及缺鐵、瘧疾、血吸蟲病、慢性腎臟病等病因導致紅細胞生成、代謝或者細胞降解異常就會導致患者貧血。當前貧血是一種全球性的健康問題，全球約1/3的人群貧血［26］。可見紅細胞生成以及貧血機制的研究是全球亟待解決的難題。給貧血患者輸注紅細胞制品是貧血治療的一種常用的臨床方法，紅細胞制品相關EVs在輸血相關免疫調節(jié)中的作用也逐步被揭示出來，例如鐮形紅細胞貧血患者的研究從一個側面揭示了紅細胞相關EVs參與了血管內皮屏障、單核細胞與內皮細胞的粘附功能。我們認為可以從以下幾點對紅細胞相關EVs進行深入研究將會為貧血相關機制的揭示以及貧血治療帶來突破性的技術和思路：①紅系造血相關EVs的機制研究；②炎癥性EVs的機制研究；③血液制品EVs檢測技術；④血液制品EVs質量及其對輸血者的造血和免疫調節(jié)等。