缺氧預(yù)適應(yīng)誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞釋放的微囊泡對正常H9c2細(xì)胞的作用

劉超，韋蘇，張琨瑋，祝倩，李燁儀，榮玉美，趙俊玉，李無為，尚曼，宋君秋，吳燕娜，劉艷霞

（天津醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)系，天津300070）

目前臨床上治療心肌梗死的方法有經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療、心臟冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)、血栓溶解療法等。缺血的心肌組織在短時(shí)間內(nèi)獲得血液再灌注和氧氣供應(yīng)的同時(shí)也加重了心肌損傷即缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷，其損傷的主要原因是缺血導(dǎo)致的細(xì)胞缺氧和細(xì)胞酸中毒等[1]。心肌缺血預(yù)適應(yīng)（ischemic preconditioning,IPC）是治療心肌I/R損傷的最具前景的方法[2]。目前心肌IPC作用的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步完善。微囊泡(microvesicles，MVs)是由質(zhì)膜直接脫落的直徑在100~1 000 nm的微小囊泡。當(dāng)細(xì)胞自身生理發(fā)生改變或受到外來刺激，如組織缺血、氧化損傷、剪切力、細(xì)胞蛋白復(fù)合物的改變等，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載，質(zhì)膜失去平衡，細(xì)胞膜褶皺形成MVs釋放到細(xì)胞外[3-4]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，大鼠IPC處理后，循環(huán)血中總MVs的含量明顯增加，且IPC-MVs通過線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)兩種途徑顯著減輕心肌I/R損傷，MVs中內(nèi)皮來源的MVs（EMVs）明顯增加，但內(nèi)皮來源的MVs在IPC對心肌的作用是未知的[5]。由于動(dòng)物水平的IPC模型受到多種體內(nèi)體外因素的影響，造成了在體模型的不穩(wěn)定，不能準(zhǔn)確的反映生物活性物質(zhì)的作用機(jī)制。因此本實(shí)驗(yàn)體外細(xì)胞HPC模型模擬體內(nèi)IPC，進(jìn)一步探討EMVs對于心肌細(xì)胞的影響，了解IPC的作用機(jī)制，為臨床治療缺血性損傷提供策略。

1　材料和方法

1.1材料人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs，中國科學(xué)院細(xì)胞庫)，H9c2心肌細(xì)胞系 (ATCC)，胎牛血清，DMEM(高糖)，青鏈霉素混合液，MTT(Solarbio)，BCA法蛋白定量檢測試劑盒（Solarbio），Hoechst33258試劑盒，Caspase 3檢測試劑盒 (江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)，LDH測定試劑盒 (南京建成生物工程研究所)，Bcl-2 抗體 (Santa Cruz)，Bax、β-actin 抗體(Cell Signaling Technology)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1HUVECs缺氧預(yù)適應(yīng)（HPC）模型的建立細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組：HUVECs細(xì)胞以6×104個(gè)/mL的密度接種于96孔板中，于95%O2-5%CO2、37℃的孵箱中培養(yǎng)24 h，HUVECs分為3組，對照組、缺氧/復(fù)氧組（H/R）和HPC組。Control組棄去上清后加入200 μL pH 7.4的對照液，于95%O2-5%CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)16h25min。H/R組和HPC組棄去上清后均加入100 μL pH 6.8的缺氧液，H/R組在于95%O2-5%CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)25 min，與H/R組不同是，HPC組做短暫缺氧/復(fù)氧處理，即預(yù)先將細(xì)胞置于缺氧裝置中以20 L/min的流速通95%N2-5%CO2混合氣10 min，隨后將HPC組細(xì)胞放置于95%O2-5%CO2、37℃的孵箱培養(yǎng)15 min。H/R組和HPC組同時(shí)進(jìn)行長時(shí)間的缺氧12 h/復(fù)氧4 h處理，即加入100 μL pH 5.8缺氧液，置于缺氧裝置中以20 L/min的流速通95%N2-5%CO2混合氣15 min達(dá)到平衡狀態(tài)后，于37℃的恒溫孵箱中進(jìn)行長時(shí)間缺氧12 h的處理，處理完成后取出兩組細(xì)胞置于95%O2-5%CO2、37℃孵箱中復(fù)氧4 h。隨后采用MTT法檢測各組細(xì)胞存活率。

1.2.2HPC-EMVs的分離提取HUVECs接種于6孔板中，HPC處理后收集細(xì)胞及上清，采用兩步離心法收集HPC-EMVs：4℃，1 800 r/min，離心20 min去除細(xì)胞碎片；收集上清液于13.2 mL超速離心管中，4℃、33 000 r/min，超速離心150 min，得到的沉淀即為 HPC-EMVs，D-hank’s重選后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3HPC-EMVs的蛋白定量采用BCA蛋白定量法對HPC-EMVs進(jìn)行蛋白含量的測定。將HPCEMVs樣品放置于冰上融化后混勻，取15 μL HPCEMVs加入30 μL的裂解液，冰上裂解30 min后混勻。參照試劑盒說明書對HPC-EMVs蛋白含量進(jìn)行檢測。

1.2.4透射電鏡觀察HPC-EMVs的形態(tài)將HPC-EMVs樣本置于冰上自然融化，待其完全融化后混勻，取40 μL HPC-EMVs懸液滴在銅網(wǎng)上，室溫靜置2 min，將多余的液體用濾紙從側(cè)面吸去。滴入等量的2%磷鎢酸染色液到未完全干的載網(wǎng)，室溫放置2 min，將多余的液體用濾紙從側(cè)面吸去。白熾燈照射使其干燥，并在透射電鏡下觀察，選擇合適的視野和放大倍數(shù)進(jìn)行拍照。

1.2.5HPC-EMVs和正常H9c2細(xì)胞共孵育將H9c2細(xì)胞以1×105個(gè)/mL的密度分別接種于培養(yǎng)板中，于95%O2-5%CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)液，對照組換用無FBS高糖DMEM培養(yǎng)基，HPC-EMVs各組換用預(yù)先用DMEM培養(yǎng)基配制的濃度為 10、30、60 μg/mL 的 HPC-EMVs 懸液，于95%O2-5%CO2、37 ℃孵箱中孵育 4 h。

1.2.6MTT法檢測細(xì)胞存活率取各組處理完成的細(xì)胞，每孔加入0.5%MTT溶液10μL，放入37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取出，吸凈孔中液體，每孔加入150 μL DMSO，將培養(yǎng)板置于酶標(biāo)儀中，調(diào)節(jié)波長為490 nm，震蕩10min，檢測各孔吸光度。按照OD檢測組/OD對照組×100%的公式計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.7比色法測定培養(yǎng)液中LDH活性分別取各組H9c2細(xì)胞培養(yǎng)液，參照試劑盒說明書采用比色法對培養(yǎng)液中LDH活力進(jìn)行檢測，LDH活性（U/L）=（測定孔吸光度-對照孔吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)孔吸光度-空白孔吸光度）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（0.2 mmol/L）×1 000。

1.2.8Hoechst 33258染色法檢測細(xì)胞凋亡DHank’s洗滌各組H9c2細(xì)胞2次，每孔加入Hoechst 33258 染色液 1 mL，室溫染色 30 min，D-Hank’s洗2~3次以去除染液，設(shè)置顯微鏡激發(fā)波長為340 nm，選擇合適的視野觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.2.9比色法測定Caspase 3活性吸取各組細(xì)胞培養(yǎng)液，備用。收集細(xì)胞于離心管中。在4℃的條件下，400 r/min，離心5 min，小心吸去上清，用D-Hank’s洗滌1次后再次離心。吸盡上清后，6孔板每孔加入含1 mmol PMSF的裂解液100 μL，混勻后，冰上裂解30 min。4℃，8 000 r/min，離心15 min提取蛋白，Bradford法測定蛋白濃度，參照試劑盒說明書使用微量酶標(biāo)儀讀取405 nm處吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中Caspase 3活性。

1.2.10Western blot檢測Bcl-2/Bax蛋白的表達(dá)收集H9c2細(xì)胞后加入Western及IP裂解液100 μL，混勻后于冰上裂解30min。4℃，8000r/min，離心15min收集蛋白，蛋白定量后取適量蛋白電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，并在其中加入Bcl-2（1∶1 000）、Bax 抗兔一抗（1∶1 000）和 β-actin（1∶1 000）抗兔一抗，4℃孵育過夜，一抗孵育結(jié)束后用TBST于搖床上洗膜，每次10 min，共3次。將PVDF膜封于新的雜交袋中，并加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗IgG（1∶1 000），室溫?fù)u動(dòng)孵育2 h，孵育結(jié)束再次洗膜。加入Bcl-2和Bax抗兔一抗（1∶1000），化學(xué)發(fā)光成像儀拍攝蛋白條帶，圖像利用Image J軟件計(jì)算Bcl-2、Bax灰度值，并計(jì)算兩者比值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 17.0軟件對測定結(jié)果進(jìn)行分析，組間比較使用單因素方差分析檢驗(yàn)，對于單因素方差分析，方差齊時(shí)，采用多組間比較LSD法；方差不齊時(shí)，采用Tamhane’s T2法。檢驗(yàn)以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果以±s表示。

2　結(jié)果

2.1成功建立HUVECs HPC模型與對照組相比，H/R組細(xì)胞存活率在70%左右，說明H/R造成細(xì)胞損傷且損傷程度適中，與H/R組相比，HPC組細(xì)胞存活率較H/R組顯著升高（94.83%±2.55%vs 75.98%±4.54%，P<0.01）（圖 1），說明 HPC 發(fā)揮了抗H/R損傷的作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定且重復(fù)性好，故成功建立HUVECs的HPC模型。

圖1　H/R和HPC模型中HUVECs存活率(n=6,±s)Fig 1　The cells viability of HUVECs in H/R and HPC model(n=6,±s)

2.2HPC-EMVs的蛋白含量和形態(tài)HPC-EMVs的蛋白定量：通過BCA法標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式計(jì)算出HPC-EMVs的蛋白含量為（0.298±0.045）μg/μL。HPC-EMVs的形態(tài)：負(fù)染法處理MVs后，在透射電鏡下，選定放大倍數(shù)為6 000倍，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HPCEMVs直徑在100~1 000 nm，形狀為圓或橢圓形，且具有和細(xì)胞相似的膜結(jié)構(gòu)，有完整的包膜，未見明顯細(xì)胞器結(jié)構(gòu)（圖2）。

圖2　透射電鏡下HPC-EMVs的結(jié)構(gòu)(負(fù)染法，×6.0 K)Fig 2　The structure of HPC-EMVs under transmission electron microscopy(negative dyeing method,×6.0 K)

2.3HPC-EMVs對H9c2細(xì)胞的損傷作用MTT檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組（100%±0%）相比，HPC-EMVs 30組（90.43%±1.21%）和HPC-EMVs 60組（73.19%±2.11%）細(xì)胞存活率明顯下降（P<0.001），但 HPCEMVs 10組的細(xì)胞存活率（96.31%±1.84%）并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與HPC-EMVs 10組相比，HPC-EMVs 30和60組細(xì)胞存活率顯著下降 （P<0.01或P<0.001）；與 HPC-EMVs 30組相比，HPC-EMVs 60 組細(xì)胞存活率亦顯著下降（P<0.001）。由此可見，隨HPC-EMVs濃度增大，H9c2細(xì)胞存活率逐漸下降，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3A。

LDH檢測顯示，與對照組（116.23 U/L±6.88 U/L）相比，HPC-EMVs 30 組（132.97 U/L±4.92 U/L）、60組(157.38 U/L±6.94 U/L)LDH活性顯著升高（P<0.01或P<0.001），但HPC-EMVs10組的LDH水平（114.25U/L±6.31 U/L）略有降低并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與HPCEMVs 10組相比，HPC-EMVs 30和60組LDH活性顯著增加（P<0.001）；與HPC-EMVs 30組相比，HPC-EMVs 60組LDH活性亦顯著增加（P<0.001）。LDH活性隨HPC-EMVs濃度的增加呈劑量依賴性顯著性增加，見圖3B。2.4HPC-EMVs對H9c2細(xì)胞的促凋亡作用及相關(guān)機(jī)制Hoechst33258染色結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞形態(tài)規(guī)則完整，細(xì)胞核染色均勻一致。HPC-EMVs處理后，HPC-EMVs 10組H9c2細(xì)胞可見個(gè)別細(xì)胞核出現(xiàn)固縮凝聚，呈致密濃染；HPC-EMVs 30組凝聚的細(xì)胞核稍增多；HPC-EMVs 60組細(xì)胞核固縮濃染明顯增多，細(xì)胞核分裂成碎片，胞核致密濃染，即凋亡細(xì)胞數(shù)目增加，見圖4A。

Caspase 3活性檢測結(jié)果顯示，與對照組（140.04 U/μg±10.37 U/μg） 比較，HPC-EMVs 60 組Caspase 3 活性顯著升高（307.29 U/μg±9.25 U/μg，P<0.001)；與 HPC-EMVs 10（142.51 U/μg±10.55 U/μg）和 HPC-EMVs 30 組（182.78 U/μg ±6.58 U/μg）比，HPC-EMVs60組Caspase3活性也有顯著增高（P<0.001），見圖4B；Western blot檢測顯示，與對照比，HPCEMVs各組隨MVs濃度增大，Bcl-2的條帶逐漸變淺，HPC-EMVs 60組條帶幾乎消失，Bax的條帶逐漸加深，Bcl-2/Bax比值降低，見圖4C。

圖3　A.HPC-EMVs對正常H9c2細(xì)胞存活率的影響(n=6,±s)B.HPC-EMVs對正常H9c2細(xì)胞培養(yǎng)上清液LDH活性的影響(n=6,±s)Fig 3 A.Effects of HPC-EMVs on normal H9c2 cell viability(n=6,±s)B.Effects of HPC-EMVs on LDH activity in supernatant of normal H9c2 cells(n=6,±s)

圖4　A.HPC-EMVs對正常H9c2細(xì)胞Hoechst染色的影響(×200);B.HPC-EMVs對正常H9c2細(xì)胞Caspase 3活性的影響(n=6,±s)；C.HPC-EMVs對正常H9c2細(xì)胞Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)的影響(n=3,±s)Fig 4 A.Effects of HPC-EMVs on Hoechst staining in normal H9c2 cells　(×200);B.Effects of HPC-EMVs on the activity of Caspase 3 in normal H9c2 cells(n=6,±s);C.Effects of HPCEMVs on the protein of Bcl-2/Baxin normal H9c2 cells(n=6,±s)

3　討論

血管內(nèi)皮功能紊亂作為心肌缺血損傷的起始環(huán)節(jié)，其與IHD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。IPC指的是短暫的剝奪特定器官或組織的血液供應(yīng)后，給予短時(shí)間的再灌注的處理，進(jìn)而對后續(xù)的長時(shí)間的缺血/再灌注損傷發(fā)揮保護(hù)作用[6]。心肌缺血/再灌注損傷常伴發(fā)嚴(yán)重的心肌損傷，心肌細(xì)胞出現(xiàn)不可逆性的凋亡和壞死。實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn)，來自H/R處理的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的微泡促進(jìn)H9c2心肌細(xì)胞的凋亡和氧化應(yīng)激[7]。本研究證實(shí)HPC-EMVs對正常H9c2心肌細(xì)胞有損傷作用，并發(fā)現(xiàn)其通過降低H9c2細(xì)胞的抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的比值，增加Caspase 3活性發(fā)揮作用。

將細(xì)胞進(jìn)行缺氧處理，是最接近在體缺血過程及機(jī)制的細(xì)胞模型[8-9]。本實(shí)驗(yàn)室前期在細(xì)胞水平選用酸性的缺氧液模擬I/R損傷時(shí)的細(xì)胞酸中毒以及通入N2-CO2混合氣模擬細(xì)胞缺氧時(shí)的無氧環(huán)境建立了I/R損傷模型并達(dá)到了良好的損傷程度和重復(fù)性，為內(nèi)皮細(xì)胞的HPC模型提供了前提[7]。因此本實(shí)驗(yàn)采用體外的細(xì)胞缺氧預(yù)適應(yīng)模型，探索內(nèi)皮細(xì)胞來源的MVs在HPC過程中的作用機(jī)制。

Caspase家族主要在凋亡的執(zhí)行階段起主要作用，凋亡的發(fā)生是一系列Caspase家族成員共同參與完成的。其中，Caspase 3被認(rèn)為是各種凋亡刺激因子激活的Caspase家族中的關(guān)鍵蛋白酶。Caspase 3可被該家族其他成員活化，引起DNA損傷修復(fù)酶降解，同時(shí)激活核酸內(nèi)切酶，從而使細(xì)胞凋亡[10]。Bcl-2家族是細(xì)胞凋亡基因之一，其中Bcl-2是原癌基因，Bcl-2可抑制細(xì)胞凋亡，而Bax的作用正好相反，Bax的表達(dá)或過表達(dá)，可促使細(xì)胞凋亡，Bcl-2/Bax的比值將決定細(xì)胞是否發(fā)生凋亡[11]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)IPC-MVs對I/R大鼠心肌具有保護(hù)作用，并證明其機(jī)制為上調(diào)I/R心肌組織中Bcl-2的蛋白表達(dá)，下調(diào)Bax的蛋白表達(dá)，降低Caspase 3活力[12]；本研究進(jìn)一步證實(shí)HPC-EMVs同樣通過下調(diào)H9c2心肌細(xì)胞中Bcl-2的蛋白表達(dá)，上調(diào)Bax的蛋白表達(dá)，下調(diào)Bcl-2/Bax的比值，升高Caspase 3活力發(fā)揮促凋亡作用。

本研究發(fā)現(xiàn)HPC-EMVs對正常培養(yǎng)的H9c2有促進(jìn)凋亡的作用，原因有如下幾點(diǎn)：首先，在MV的提取時(shí)間方面，本研究對HUVECs進(jìn)行短暫缺氧/復(fù)氧后又進(jìn)行了長時(shí)間的缺氧/復(fù)氧處理，最終提取的MVs，不排除在長時(shí)間的缺氧/復(fù)氧中，產(chǎn)生了損害性的MVs的可能。其次，在MVs的作用效果方面，本實(shí)驗(yàn)前期發(fā)現(xiàn)IPC-MVs對于正常的H9c2細(xì)胞有促進(jìn)凋亡的作用，但對于H/R損傷的心肌細(xì)胞有保護(hù)作用，即MVs發(fā)揮了雙向的作用。總之，血管內(nèi)皮功能障礙是與缺血性心臟病密切相關(guān)的決定因素。然而內(nèi)皮MVs對心肌損傷的潛在貢獻(xiàn)尚不清楚，探索MVs的作用機(jī)制成為目前的重點(diǎn)。

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