曲美他嗪預處理對缺血/再灌注大鼠心肌細胞凋亡的抑制及機制研究

熊 果，馬康華

（四川省宜賓市第一人民醫院心血管內科，宜賓644000）

本文涉及的環磷酸腺苷反應蛋白結合元件（cAMP-response element binding protein,CREB）是真核細胞內核轉錄調節因子[1]，受多因素激活，G蛋白-環化單磷酸腺苷-蛋白激酶A系統（G蛋白-cAMP-PKA）途徑是CREB的經典調節通路，活化的PKA轉入細胞核，磷酸化激活CREB；pser133-CREB是CREB的活性形式，p-CREB形成同源二聚體（有活性）或與其他蛋白形成異源二聚體（無活性），再與真核生物啟動子中的CRE結合，并在其輔因子（CREB結合蛋白)協同作用下，通過調控凋亡相關基因（如Bcl-2，Caspase3等）的表達，調控細胞凋亡[2-3]。本研究通過構建大鼠缺血/再灌注心肌模型，旨在探討曲美他嗪（trimetazidine，TMZ）抑制缺血/再灌注大鼠心肌細胞凋亡的效果及其與CREB、p-CREB、Bcl-2及Caspase-3的相關性。

1　材料與方法

1.1實驗動物與分組成年雄性SD大鼠60只，體質量260～300g(重慶醫科大學實驗動物中心提供)，隨機分成假手術組（Sham組）、缺血/再灌注組（I/R組），TMZ預處理缺血/再灌注組（T+I/R組)，3組各20只。

1.2動物模型構建將大鼠固定在手術臺上，用3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉（10 mL·kg-1），氣管插管后用小動物專用呼吸機輔助通氣（頻率80次·min-1；吸呼比 1:1；潮氣量 4~5 mL·kg-1）；然后在其胸骨左緣3、4肋間打開胸腔暴露心臟，在肺動脈圓錐與左心耳之間距主動脈根部約3 mm處用6-0帶針絲線結扎左前降支（LAD）（墊以3 mm長橡皮筋），待缺血45 min后松開結扎線，再灌注180 min。建模成功的標準：結扎LAD后缺血區立即變蒼白，心電圖Ⅱ導聯ST段出現弓背樣向上抬高，表示心肌缺血；松解LAD后缺血區由蒼白漸變為紅潤，抬高的ST段下降1/2以上，表示再灌注成功，Sham組只穿線不結扎。

T+I/R組大鼠的曲美他嗪預處理方法：本組在實驗模型構建前給予曲美他嗪10 mg·kg-1·d-1喂養大鼠14 d，然后按上述辦法造模。另外，所有大鼠喂養相同專用飼料，除T+I/R組灌胃曲美他嗪10 mg·kg-1·d-1外，Sham 組及 I/R 組灌胃等體積的生理鹽水，每天灌胃時間15:30～16:00。

1.3標本采集與制作各組大鼠均在無菌條件下被分離出建模成功的心臟，然后以冰焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)水灌洗，并剪去大血管、左右心房及右心室，在結扎線以下將左心室分離成兩部分：一份用4%多聚甲醛固定24 h，最后在70%乙醇中保存以備石蠟包埋切片；在另一份中取100 mg左右心肌組織，用無菌錫箔紙包裹，經液氮冷凍24 h后在-80℃冰箱保存以備檢測逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）。

1.4心肌細胞凋亡的原位末端標記分析法（TUNEL） 試劑購于武漢博士德公司。把石蠟包埋的心肌組織切片（2 μm），脫蠟至水，然后用3%雙氧水及甲醇處理，再經PBS漂洗3×5 min，加入蛋白酶K工作液常溫20 min，再次PBS漂洗3×5 min后，加入TUNEL反應液37℃濕盒避光孵育1 h，又以PBS漂洗3×5 min后，在HRP抗體37℃濕盒中避光孵育30 min后循環進行PBS漂洗3×5 min、DAB顯色 8 min、PBS 漂洗 3×5 min、蘇木素復染 5~10 s，最后以流水沖洗后脫水，用透明、中性樹膠封片。其中，上述實驗陰性對照用PBS代替HRP抗體。

心肌細胞凋亡計數方法：在缺血再灌注損傷區隨機選取5個非重疊高倍視野（×400），計數凋亡細胞數和心肌細胞總數，心肌細胞凋亡指數（AI）=心肌細胞凋亡數/心肌細胞總數×100%。

1.5p-CREB蛋白表達的免疫組化分析方法按照SP試劑盒說明書操作（美國ABCAM公司）。抗p-CREB抗體稀釋度為1∶250，以PBS代替一抗作為陰性對照。其中，棕黃色顆粒即為陽性表達（p-CREB主要在胞核中表達）。在重慶醫科大學醫學病理圖像分析系統中進行圖像分析，用標準灰度校正后，每個標本隨機取5個視野，測量平均積分光密度值（IDP），其均值為該標本所得值。

1.6Bcl-2及Caspase-3蛋白表達的免疫熒光分析方法操作步驟嚴格按照試劑（Santa Cruz公司）說明書。抗Bcl-2及Caspase抗體稀釋濃度均為1∶100，同時以PBS代替一抗作陰性對照。標本中加入綠色熒光二抗（1∶100），經37℃孵育后，加胞核染色劑，在激光共聚焦顯微鏡下成像。在北航計算機醫學病理圖像分析系統中進行圖象分析，標準灰度校正后，每個標本隨機取5個視野，測量平均積分光密度值(IDP)，其均值為該標本所得值。

1.7CREB、Bcl-2、Caspase-3的 mRNA 表達的 RTPCR分析方法以異硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法提取心肌組織總RNA，并且進行逆轉錄，以cDNA作為PCR反應模板，β-actin為內參。引物、目的片段長度及核酸解鏈溫度（Tm）見表1。

表1　RT-PCR引物序列、代碼、堿基大小及退火溫度Tab 1　RT-PCR primer sequences,code,base sizes and annealing temperature

PCR反應條件：94℃5 min（預變性），94℃50 s（變性），退火50 s，72℃ 2 min（延伸），72℃ 5 min（再延伸），總共35個循環。取反應產物10 μL于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，Bio-Rad凝膠成像分析系統處理，目的片段與內參β-actin吸光度比值為目的片段mRNA的相對表達量。

1.8統計學處理采用SPSS19.0統計軟件包處理，數據以±s表達，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組心肌細胞凋亡指數Sham組偶見心肌細胞凋亡，凋亡指數2.20%（2.20±0.15）；I/R組可見大量細胞凋亡，凋亡指數高達36.5%（36.5±2.45），與Sham組比較差異有顯著統計學意義（P<0.01）；T+I/R組細胞凋亡指數16.5%（16.5±1.25），高于Sham組（P<0.01），低于 I/R 組（P<0.05），差異均有統計學意義（圖 1）。

圖1　TUNEL法檢測心肌細胞凋亡(×400)Fig 1　Cardiocyte apoptosis detected by TUNEL(×400)

2.2各組心肌 CREB、Bcl-2、Caspase-3蛋白及mRNA的表達CREB蛋白及mRNA在Sham組蛋白有一定量表達，在I/R組表達最少，T+I/R組表達最高，差異有統計學意義；p-CREB蛋白及mRNA在Sham組少量表達，在I/R組表達適當增加，在T+I/R組表達最多（P＜0.05）。Sham組的Bcl-2在蛋白與基因水平均高表達，在I/R組呈低表達，在T+I/R組表達水平較I/R組顯著增加（P＜0.05），仍明顯少于Sham組（P＜0.05）。Sham組的Caspase-3在基因及蛋白水平少量表達，在I/R組呈高表達，在T+I/R組表達水平較I/R組低，但仍高于Sham組（P<0.05）（圖 2～5，表 2，3）

圖2　各組p-CREB免疫組化表達的比較(×400)Fig 2 Comparison of the expression of CREB among groups(immunohistochemistory,×400)

圖3　各組Bcl-2免疫熒光表達的比較(×400)Fig 3 Comparison of the expression of Bcl-2 among groups(immunofluorescence,×400)

圖4　各組Caspase-3免疫熒光表達的比較(×400)Fig 4 Expression of Caspase-3 among groups(immunofluorescence,×400)

圖5　各組CREB、Bcl-2、Caspase-3的mRNA表達情況Fig 5 Comparison of the mRNA expression of CREB,Bcl-2 and Caspase-3 among groups(RT-PCR)

表2　各組大鼠心肌細胞CREBmRNA、p-CREB蛋白表達比較(±s，%)Tab 2 Expression of CREBmRNA and p-CREB protein in ratscardiocyte among three groups(±s，%)

表2　各組大鼠心肌細胞CREBmRNA、p-CREB蛋白表達比較(±s，%)Tab 2 Expression of CREBmRNA and p-CREB protein in ratscardiocyte among three groups(±s，%)

vs I/R group，aP<0.05，bP<0.05

組別　n　C R E B（m R N A）　p-C R E B蛋白S h a m　2 0　2 7.5±2.0 a　2 0.8±2.4 a I/R　2 0　2 4.5±1.6　4.1±2.3 I/R+T　2 0　3 0.5±2.5 ab　2 8.6±2.0 ab

表3　各組大鼠心肌細胞Bcl-2及Caspase-3蛋白及mRNA的比較(±s，%)Tab 3 Comparison of the protein and mRNA expression of Bcl-2 and Caspase-3 in rats cardiocyte among three groups

表3　各組大鼠心肌細胞Bcl-2及Caspase-3蛋白及mRNA的比較(±s，%)Tab 3 Comparison of the protein and mRNA expression of Bcl-2 and Caspase-3 in rats cardiocyte among three groups

vs I/R group，aP<0.05，bP<0.05

組別　n　B c l-2 S h a m　2 0　6 1.9±2.9 a I/R　2 0　2 1.4±3.2 T+I/R　2 0　4 9.7±3.1 ab C a s p a s e 3 3 8.1±4.5 a 7 2.8±5.7 4 7.2±5.1 ab B c l-2(m R N A)3 7.0±2.0 a 1 1.0±2.0 2 5.0±3.0 ab C a s p a s e-3(m R N A)6.2±0.9 a 2 5.5±4.8 1 4.4±3.6 ab

3　討論

3.1曲美他嗪抗心肌缺血及抑制缺血/再灌注心肌細胞凋亡的效果曲美他嗪是臨床上用于缺血性心肌病的一種改善心肌能量代謝的藥物，主要機制是通過抑制脂肪酸β氧化，促進葡萄糖氧化代謝，提高心肌細胞產能效率，從而緩解心肌缺血，減少心肌細胞凋亡[4-6]。在心肌缺血再灌注損傷時細胞發生凋亡的機制[7]主要包括氧化損傷、影響線粒體功能和能量代謝、鈣穩態失衡等，而曲美他嗪抗心肌缺血具體環節是選擇性的作用于線粒體酶-長鏈3-酮酰輔酶A-硫解酶（3-KAT）、增進葡萄糖氧化（低耗氧產能途徑），提高心肌細胞氧的利用率，從而增加ATP的合成[8]，與此同時還能顯著減輕細胞內酸中毒、減輕Ca2+超載、減少自由基損害、減少細胞凋亡以及抑制白介素的抗炎效應，從而起到保護心肌細胞的作用[9]。

本實驗的短期曲美他嗪預處理對照發現，TUNEL法檢測Sham組有少量心肌細胞凋亡，缺血再灌注組心肌細胞凋亡明顯，而曲美他嗪預處理組心肌細胞凋亡明顯減少，但仍顯著高于Sham組，證實曲美他嗪預處理能明顯抑制缺血再灌注損傷所致的心肌細胞凋亡，與Ma等[10]、?Sentürk等[5]、Liu等[11]的動物實驗和McCarthy等[12]、Zhang等[13]報道的患者臨床研究結果一致。國內僅見個別曲美他嗪預處理對大鼠[14-15]、家兔[16]心肌酶學保護及提高體內自由基清除能力、減輕脂質過氧化等機制從而減輕缺血再灌注損傷的作用報道，但是還罕見涉及曲美他嗪抗凋亡的問題。

3.2曲美他嗪抑制缺血/再灌注大鼠心肌細胞凋亡的可能機制盡管已經有不少研究明確了曲美他嗪預處理具有抑制缺血再灌注損傷所致的心肌細胞凋亡作用，但曲美他嗪抗凋亡的確切機制目前仍未完全釋清，CREB和p-CREB是否參與曲美他嗪對心肌細胞的保護作用，目前少見報道。

本實驗發現，Sham組CREB及p-CREB均有一定量表達，I/R組CREB表達減少，p-CREB表達明顯減少，而曲美他嗪組CREB及p-CREB表達則明顯增加，提示曲美他嗪預處理上調了CREB和p-CREB表達水平，這可能是其減少心肌細胞凋亡的主要作用機制之一。因為基礎研究已經發現p-CREB與真核生物啟動子中的CRE結合后在其輔因子（CREB結合蛋白)協同作用下，能夠調控凋亡相關基因（如Bcl-2，Caspase-3等）的表達，發揮調控細胞凋亡的作用；而本實驗同時研究看到了曲美他嗪預處理組下游環節發生了Bcl-2上調（產生抗凋亡作用）、Caspase-3（具有致凋亡作用）下調的相應效應改變，再加上上述曲美他嗪預處理組心肌凋亡明顯減少的直接結果，初步說明了曲美他嗪對CREB和p-CREB表達水平的影響就是其抗凋亡機制或者環節的假設；而I/R組心肌細胞CREB表達減少可能與該區域心肌細胞壞死或凋亡增加有關，這一組缺乏曲美他嗪預處理保護的結果就是上述結論的強有力的陰性對照說明。

上述機制可用基礎研究結果解釋：組織缺血再灌注后氧化應激增加主要歸因于線粒體功能的損害[17]，導致細胞損傷和死亡，而死亡的主要形式有腫脹壞死、壞死性凋亡、細胞凋亡和自噬；關于凋亡，線粒體功能受損時，線粒體膜腫脹，膜通透性增高，使線粒體內促凋亡分子如抑制細胞色素C、凋亡誘導因子（AIF）、凋亡蛋白酶激活因子（Apaf）等釋放，啟動細胞凋亡機制[17]。細胞凋亡過程受多種基因的調控，其中最重要的是Bcl-2與Caspase-3。Bcl-2也可通過干擾細胞色素C的釋放而阻斷上游Caspase蛋白酶的激活，抑制細胞凋亡[18]，Bcl-2基因家族是目前公認與凋亡密切相關的基因[19]，Bcl-2基因產物主要位于線粒體膜、核膜及內質網膜上，Bcl-2基因可抑制許多因素引起的細胞凋亡，成為抗凋亡主要蛋白[19]。這與本實驗Sham組細胞凋亡最少，但是Bcl-2表達最高；缺血再灌注組細胞凋亡最多，但是Bcl-2呈低水平表達；而曲美他嗪預處理組Bcl-2表達雖低于Sham組，但明顯高于缺血再灌注組的結果完全契合，這是曲美他嗪預處理減少凋亡的機制環節之二，也與Cook等[20]報道相似。另外，Caspase-3是細胞凋亡的最終執行者，一旦被激活便激發下游的級聯反應，啟動細胞凋亡[21]。本研究異曲同工地發現曲美他嗪預處理能顯著下調Caspase-3的蛋白及基因表達水平，從而使心肌細胞凋亡顯著減少，強烈提示曲美他嗪抑制缺血再灌注大鼠心肌細胞凋亡機制之三是抑制Caspase-3活化，下調Caspase-3表達。

3.3本實驗的不足及臨床應用建議本研究僅僅是一個橫斷面的初步、短期預處理的實驗研究，其價值具有初步闡明曲美他嗪預處理對心肌缺血再灌注損傷之心肌凋亡有抑制作用及其具有分子水平的可能機制的意義，但是因為本實驗樣本量偏小，尚需大樣本的動物實驗及基礎、臨床研究，進一步研究他們之間是否確切存在上下游調控關系，以及相關的具體信號通路之間是如何更加細致地實現調控的；今后還需要中長期的研究、隨訪進一步證明該作用是否具有持久性。臨床上可以觀察冠心病患者分成常規治療組及加用曲美他嗪治療組發生急性心肌梗死后相同處理方法的不同心肌存活、臨床轉歸差異來加以詮釋。

參考文獻：

[1]Noda T,Minami K,Kojima A,et al.Expression patterns of the activator type of cAMP-responsive element modulator in testicular germ cells of Japanese Black bulls[J].Theriogenology,2014,81(8):1012

[2]Yang J,Fan Z,Yang J,et al.MicroRNA-22 attenuates myocardial ischemia-reperfusion injury via an anti-inflammatory mechanism in rats[J].Exp Ther Med,2016,12(5):3249

[3]Li W,Suwanwela N C,Patumraj S.Curcumin prevents reperfusion injury following ischemic stroke in rats via inhibition of NFκB,ICAM-1,MMP-9 and caspase-3 expression[J].Mol Med Rep,2017,16(4):4710

[4]Yang Q,Yang K,Li A Y.Trimetazidine protects against hypoxiareperfusion-induced cardiomyocyte apoptosis by increasing microRNA-21 expression[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(4):3735

[6]郭麗蓉，孫常青.鹽酸曲美他嗪對心肌缺血再灌注大鼠Fas、FasL基因表達的影響[J].中國生化藥物雜志，2014，34（9）：27

[7]Wei B R,Young R F,Shen X,et al.Brief myocardial ischemia produces cardiac troponin I release and focal myocyte apoptosis in the absence of pathological infarction in swine[J].JACC Basic Transl Sci,2017,2(2):105

[8]Tsioufis K,Andrikopoulos G,Manolis A.Trimetazidine and cardioprotection:facts and perspectives[J].Angiology,2015,66(3):204

[9]Danikiewicz A,Szkodziński J,Hudzik B,et al.Effects of trimetazidine on interleukin-2 and interleukin-8 concentrations in patients with coronary artery disease[J].Can J Physiol Pharmacol,2017,95(6):759

[10]Ma N,Bai J,Zhang W,et al.Trimetazidine protects against cardiac ischemia/reperfusion injury via effects on cardiac miRNA?21 expression,Akt and the Bcl2/Bax pathway[J].Mol Med Rep,2016,14(5):4216

[11]Liu Z,Chen J M,Huang H,et al.The protective effect of trimetazidine on myocardial ischemia/reperfusion injury through activating AMPK and ERK signaling pathway[J].Metabolism,2016,65(3):122

[12]McCarthy C P,Mullins K V,Kerins D M.The role of trimetazidine in cardiovascular disease:beyond an anti-anginal agent[J].Eur Heart J Cardiovasc Pharmacother,2016,2(4):266

[13]Zhang N,Lei J,Liu Q,et al.The effectiveness of preoperative trimetazidine on myocardial preservation in coronary artery bypass graft patients:a systematic review and meta-analysis[J].Cardiology,2015,131(2):86

[14]趙艷芳，秦永文，王學敏,等.曲美他嗪對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用[J].第二軍醫大學學報，2003，24（3）：324

[15]顏永進，張躍明，陸洋,等.曲美他嗪對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用[J].江蘇醫藥，2011，37（1）:20

[16]王健，黃元偉，魏經漢,等.曲美他嗪對家兔心肌缺血再灌注損傷的保護作用[J].浙江大學學報醫學版，2003，32（3）:219

[17]Maximilian Buja L.Mitochondria in ischemic heart disease[J].Adv Exp Med Biol,2017,982:127

[18]Li Q,Guo Y,Li X,et al.The interference of picroside II on the expressions of caspase-3 and PARP following cerebral ischemia reperfusion injury in rats[J].Chin Pharmacol Bull,2010,26(3):342

[19]Kumar P，Coltas I K，Kumar B,et al.Bcl-2 protects endothelial cells against gamma-raditation via a Raf-MEK-ERK surviving signaling pathway that is independent of cytochrome c release[J].Cancer Res,2007,67(3):1193

[20]Cook A S,Sugden P H,Clerk A.Regulation of Bcl-2 family protein during development and in response to oxidative stress in cardiac myocyte：association with changes in mitochondrial membrane potential[J].Circ Res，1999,85:940

[21]Sun J P,Liu J H,Recnt advance of Apaf-1,Caspase-9 and apoptolic mechanisms[J].China J General Practice,2013,11(7):1102