用于腫瘤靶向性X線CT造影劑和抗腫瘤藥物傳遞的多功能含碘納米粒子的制備和表征

朱 穎 ，張 巖 ，陳　研 ，楊曉英

（1.天津醫(yī)科大學藥學院，天津市臨床藥物關鍵技術重點實驗室，天津300070；2.天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院藥學部，天津 300211）

計算機斷層掃描（CT）是目前臨床上應用最廣泛的非侵入性成像診斷技術之一，在臨床已經使用大半個世紀。為增強軟組織的對比度，人們研制了多種CT造影劑。目前臨床上廣泛使用的水溶性造影劑均為三碘苯環(huán)的衍生物，如碘海醇、碘帕醇、碘普羅胺、泛影葡胺等。然而，由于這些CT造影劑均為含碘小分子，在體內循環(huán)時間短，無選擇性，大劑量使用又會導致嚴重不良反應及部分患者過敏的問題，因而極大地限制了它們在一些部位如腫瘤、肝、淋巴結等部位的靶向成像和血管造影[1]。過去十幾年中，研究者利用納米粒子的可體內長循環(huán)、實體瘤組織的高通透性和滯留效應（EPR效應）、容易進行表面修飾及整合多功能于一體等獨特的性能來解決這一問題。大量研究集中于將臨床應用的碘代小分子發(fā)展成碘代納米粒子，包括乳液[2-3]、脂質體[4-7]、脂質蛋白[8-9]、聚合物納米粒子[10-14]和不溶性納米材料[15]等。這些納米材料的主要目的是增加碘的濃度和達到一定粒徑，使其對比度能高于常規(guī)水溶性CT對比劑，并達到與臨床所用碘代小分子對比劑不一樣的體內動力學效果。此外，一些研究將具有高吸收X線性能的金屬和無機納米粒子引入碘對比劑，用以增加其對比性能。如金元素由于具有比碘高的原子序數(shù)以及對X線衰減貢獻較大的光電效應，受到廣泛關注，許多基于Au納米粒子的對比劑用于體內X線CT成像[16-18]。我們之前的研究[19]和Peng等[20]的研究結果均表明，當金與碘這兩種高度不透X線的元素結合在一起時，二者具有協(xié)同作用，顯示出顯著增強的X線衰減效應。為將納米粒子靶向到腫瘤組織，實現(xiàn)腫瘤靶向性藥物遞送和生物成像，通常采用配體-受體結合系統(tǒng)或抗體-抗原結合系統(tǒng)實現(xiàn)主動靶向作用。葉酸（FA）是應用較早的腫瘤靶向分子，與其在正常組織中的表達水平相比，F(xiàn)A受體在大腸癌、卵巢癌和乳腺癌等上皮惡性腫瘤中過表達[21-23]。研究表明，F(xiàn)A是FA受體的高親和配體（Kd≈10-10mol/L）[24]，F(xiàn)A修飾的載體可以通過受體介導的內吞作用被FA受體高表達的細胞高效攝取[25]。本研究采用沉淀聚合法制備了含碘聚合物納米粒子P(MATIB-co-MBA-co-GMA)，并將FA分子修飾到該納米粒子表面，然后在該納米粒子內部和表面沉積金納米粒子（AuNP），最終得到P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子，作為腫瘤靶向性X線CT造影劑，同時以該納米粒子為載體，以抗腫瘤藥物鹽酸阿霉素（DOX）為藥物模型，研究了該納米粒子作為抗腫瘤藥物輸送載體的性能，以期獲得能同時實現(xiàn)腫瘤靶向性成像和藥物遞送的納米粒子系統(tǒng)，實現(xiàn)腫瘤的診治一體化。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器

1.1.1試劑N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺（MBA）購自天津中信凱泰化工有限公司，純度為98%，使用前用丙酮重結晶；甲基丙烯酸縮水甘油酯（GMA）、乙二胺（EDA）、偶氮二異丁腈（AIBN）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）均購自上海阿拉丁試劑有限公司；氯金酸（HAuCl4）購自天津市風船化學試劑科技有限公司；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）購自西格瑪奧德里奇貿易有限公司；DOX購自上海浩然生物技術有限公司。

1.1.2儀器核磁共振波譜儀（Bruker,400MHZ Advance）；透射式電子顯微鏡（Hitachi，HT7700）（TEM）；傅立葉變換紅外光譜儀（Bruker，Tensor 27）（FT-IR）；紫外-可見吸收光譜儀（JASCO，V-570）（UV-vis）；激光粒度儀（Malvern，Zetasizer Nano-ZS）；CT 掃描儀（PHILIP MX-16 SLICE）；Countstar自動細胞計數(shù)儀（上海睿鈺生物科技有限公司，IC 1000）；CO2培養(yǎng)箱（Forma Scientific）；酶標儀（Promega，GloMax-Multi）。

1.2實驗方法

1.2.1單體化合物2-甲基丙烯酰（3-酰胺-2，4，6-三碘苯甲酸）(MATIB)的合成在50 mL的雙頸圓底燒瓶中加入16 mL用分子篩干燥的N,N-二甲基乙酰胺（DMA）溶液，然后加入3-氨基-2,4,6-三碘苯甲酸（4.0 g），超聲使其完全溶解。圓底燒瓶上面依次連接冷凝管、標口玻璃彎形干燥管，冷凝管通水，將圓底燒瓶置于油浴中加熱，使反應體系維持在25℃之下，使用5 mL的注射器將甲基丙烯酰氯（2.5 mL）緩慢逐滴滴加到溶解有3-氨基-2,4,6-三碘苯甲酸的DMA的溶液中，滴加完成之后，將該反應體系溫度升高到50℃，并使該反應體系維持50℃繼續(xù)反應12 h，反應結束后，將上述反應液在25℃下緩慢滴入80 mL水中，持續(xù)攪拌反應5 h后，將所得沉淀依次用超純水、乙腈洗滌3遍。所得產物放于50℃的真空干燥箱中干燥。使用無水乙醇對產物進行重結晶，然后置于50℃的真空干燥箱中干燥。

1.2.2含碘聚合物納米粒子P（MATIB-co-MBA-co-GMA）的制備在250 mL的圓底燒瓶中，稱取單體MATIB（900 mg），加入144 mL乙腈，14.4 mL乙醇，超聲使其完全溶解，然后加入交聯(lián)劑MBA（150 mg）和引發(fā)劑 AIBN（22 mg），使其溶解。將圓底燒瓶置于85℃油浴中加熱，使反應體系在30 min內沸騰并回流。反應65 min時加入GMA（110 mg），反應80 min時終止反應。反應體系快速降溫后，產物離心（12 000 r/min，20 min）獲得，用乙腈洗 3次，在真空干燥箱中干燥至恒重，得到P(MATIB-co-MBA-co-GMA)含碘納米粒子。

1.2.3FA修飾的含碘聚合物納米粒子P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA的制備向無水甲醇（6 mL）中加入P（MATIB-co-MBA-co-GMA）納米粒子40 mg，超聲使其分散，加入 EDA（3 mL），25 ℃下攪拌 2 d，離心得到 P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-EDA 納米粒子，用無水甲醇洗3次，在真空干燥箱中干燥至恒重。

將 FA（40 mg）超聲溶于 DMSO（4 mL），與 EDC（35 mg）和 NHS（21 mg）混合，37 ℃下攪拌 60 min，將前一步得到的P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-EDA納米粒子（40 mg）加入該黃色透明液體中，繼續(xù)避光攪拌 4 d，離心得到 P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA納米粒子，用DMSO和水洗至紫外-可見吸收光譜儀檢測不到上清液中的FA分子。

1.2.4AuNP在含碘聚合物納米粒子P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA上的沉積取P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA納米粒子15 mg，溶于10 mL去離子水中，另取 HAuCl4·2H2O（15 mg）溶于 5 mL 去離子水中，加入該納米粒子水溶液中，避光下磁力攪拌 24 h，然后將反應液離心（12 000 r/min，20 min），沉淀產物用去離子水洗3遍，將其重新分散于20 mL去離子水中，之后在快速攪拌下，迅速加入含有3.5 mL NaBH4（200 mmol/L）的NaOH（100 mmol/L）溶液，當NaBH4加入后，溶液體系由淺黃立即變?yōu)樯罴t色，繼續(xù)磁力攪拌120 min，產物離心并用去離子水洗3遍，即得到P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FAAuNP納米粒子。

1.2.5P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP 納米粒子的表征分別取各步所得的納米粒子分散液，滴在碳膜銅網上，待自然晾干后于TEM下觀測并攝片記錄。分別用Nano measurer軟件測量TEM圖片中納米粒子（＞100個）的直徑，采用激光粒度儀統(tǒng)計各納米粒子在溶液中的Zeta電位、粒徑和粒徑分布情況。采用FT-IR光譜儀分別檢測各步所得納米粒子的紅外特征光譜圖。樣品分別與溴化鉀以1∶50的比例在研缽中研磨混勻后，壓溴化鉀窗片，用傅里葉-紅外光譜儀掃描樣品，得出樣品的紅外吸收光譜圖。采用UV-vis吸收光譜儀分別檢測各步所得納米粒子的UV-vis吸收光譜圖。

1.2.6P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP 納米粒子的CT造影性能對P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子溶液的體外CT造影性能進行測定，即測定該納米粒子溶液的體外CT值。首先采用電感耦合等離子體質譜分別測定P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP和 P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA納米粒子中的碘含量和金含量，然后將其分別配制成一系列不同碘濃度的水溶液，用飛利浦MX-16SLICE型CT成像儀進行CT成像斷層掃描，分別讀取各溶液中3處不同位置處的CT值，同時對比醫(yī)用碘海醇溶液的CT值。CT成像斷層掃描的各種參數(shù)為：層厚1.5 mm；間距0.75 mm；電壓90 kV；電流34 mAs。以讀出的各CT值為縱坐標，各溶液的碘濃度為橫坐標進行作圖，CT值均為3次讀數(shù)的平均值。

1.2.7P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP 納米粒子的載藥和釋藥性能將一系列不同初始濃度的DOX溶液分別與相同量的P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP（0.5 mg/mL）溶液混合均勻，置于搖床上，室溫條件下避光溫和地振搖24 h，離心得到負載DOX的納米粒子，并通過UV-vis吸收光譜儀測定上清溶液在480 nm處的吸收，計算得到上清溶液中DOX的濃度。初始溶液中DOX的總量與負載后上清溶液中的DOX的量之差即為負載在該聚合物納米粒子上的藥量。納米粒子的載藥量和包封率按照公式（1）和（2）計算得到：

其中Wadministereddose指初始溶液中DOX的質量，Wresidualdoseinsolution指負載后上清溶液中DOX的殘余量，Wnanoparticles指用于載藥的納米粒子的質量。

根據載藥性能檢測結果，制備載藥（DOX溶液初始濃度為 414 μg/mL）P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子（1.0 mg/mL），測定負載DOX后的P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子分別在不同pH值的PBS緩沖溶液（50 mmol/L，pH 6.0或7.4）中37℃下的體外釋藥性能。即將載藥納米粒子分散于8 mL水中，分為2等份，分別置于截留分子量為3 500的透析袋中，再將透析袋分別置于不同pH條件下的60 mL緩沖溶液中，緩慢攪拌進行釋藥，每個條件平行做3組。在每個設定的時間點從釋藥容器內取出1.5 mL溶液，測定其在480 nm處的紫外吸收，計算得到其中DOX的濃度。為保持藥物釋放體系的體積不變，每次取樣后向容器內補加相同條件的等量新鮮的緩沖鹽溶液。以停止釋藥實驗時穿過透析膜釋放的藥物分子總量表示累積釋放藥量。

1.2.8P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP 納米粒子的細胞吸收性能采用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察負載DOX的P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子的入胞能力，以負載DOX的P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-AuNP納米粒子作為對照.分別將終濃度為1 μg/mL的負載DOX的 P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子和P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-AuNP納米粒子與人乳腺癌MCF-7細胞孵育0.5 h后，通過共聚焦熒光顯微鏡觀察。進一步采用流式細胞分析儀檢測該納米粒子的腫瘤細胞靶向性。

1.2.9P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP 納米粒子的細胞毒性將負載DOX的P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子和 P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-AuNP納米粒子按照不同DOX濃度配制一系列載藥納米粒子溶液，以游離DOX溶液做對照。

人乳腺癌細胞MCF-7培養(yǎng)于含10%胎牛血清FBS和1%青/鏈霉素的細胞DMEM培養(yǎng)液中，在5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將MCF-7細胞按約每孔5 000個細胞的濃度接種于96孔板中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d后，將一系列不同濃度的P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子溶液加入其中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，在酶標儀上測定490 nm波長處的吸光值，按公式（3）計算上述細胞的相對存活率。對于載藥納米粒子，按 0.01、0.05、0.1、0.5、1、2.5、5 μg/mL的DOX濃度分別加入載藥納米粒子溶液和游離DOX溶液到MCF-7細胞中，并按照上述方法測定其細胞存活率。

其中，W為相對細胞存活率，A為實驗孔吸光值，A0為空白孔吸光值，A1為對照孔吸光值。

2　結果

2.1單體化合物MATIB的表征產物MATIB的化學結構采用核磁共振波譜氫譜進行表征，如圖1所示，在其氫譜圖中1.95 ppm處出現(xiàn)-CH3的質子峰，5.92 ppm和5.56 ppm處出現(xiàn) =CH2的質子峰，8.35 ppm處出現(xiàn)Ar-H處的質子峰，9.93 ppm為Ar-COOH中的質子峰，13.95 ppm為-NH-中的質子峰。因而從該核磁譜圖可以確定MATIB的結構。

圖1MATIB在DMSO-d6中的1H NMR譜圖Fig 11H NMR(400 MHz)spectrum of MATIB in DMSO-d6

2.2納米粒子的結構與形貌表征P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子的制備方法如圖2所示，先將3-氨基-2，4，6-三碘苯甲酸進行甲基丙烯酰化，得到可用于聚合的單體化合物MATIB。再將其與MBA和GMA通過沉淀聚合方法進行共聚反應，得到具有交聯(lián)結構和表面有環(huán)氧基團修飾的含碘聚合物納米粒子P（MATIB-co-MBA-co-GMA）。然后通過EDA在納米粒子表面引入氨基，并進一步通過EDC縮合反應將FA分子修飾在納米粒子表面，得到P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA納米粒子。最后，通過還原法在納米粒子上原位沉積AuNP，得到P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子。

圖2P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP納米粒子的制備示意圖Fig 2 Schematic illustration for preparation of P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP nanoparticles

2.2.1TEM表征由圖3可知，所制備的納米粒子均為表面光滑、大小均一的球形，并具有較好的分散性。P(MATIB-co-MBA-co-GMA)納米粒子平均粒徑為102 nm，當表面修飾了FA分子并沉積了AuNP后，所得的P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子平均粒徑為135 nm，并且在其上可觀察到均勻分布的粒徑小于5 nm的AuNP。

2.2.2FT-IR光譜和UV-vis吸收光譜 P（MATIB-co-MBA-co-GMA）納米粒子和P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子的FTIR光譜和UV-vis吸收光譜在P（MATIB-co-MBA-co-GMA）納米粒子的FT-IR光譜中可以看到1 657 cm-1和1 517 cm-1處分別出現(xiàn)了屬于酰胺基團中的C=O伸縮振動峰和N-H的彎曲振動峰，即酰胺I帶和酰胺II帶，在1 731 cm-1處出現(xiàn)了屬于羧基的C=O伸縮振動峰。當與FA分子連接并沉積了AuNP后，所得的P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子中原先屬于羧基的C=O伸縮振動峰消失，并且屬于酰胺基團的酰胺I帶和II帶譜峰的位置均發(fā)生了位移，說明FA分子通過酰胺鍵成功修飾到納米粒子表面。在P（MATIB-co-MBA-co-GMA）納米粒子的UV-vis吸收光譜中可以看到，在250 nm處出現(xiàn)了屬于納米粒子中苯環(huán)共軛體系的特征吸收峰，在修飾FA分子后，在304 nm處出現(xiàn)了FA分子相對應的吸收峰，相比游離FA分子在280 nm處的吸收峰紅移了24 nm。在P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子的UV-vis吸收光譜中位于500nm左右的屬于AuNP的吸收峰極其微弱，可能由于相比苯環(huán)的特征吸收峰較弱所致。而屬于納米粒子中苯環(huán)共軛體系的特征吸收峰出現(xiàn)在226 nm處，發(fā)生了24 nm的藍移，可能AuNP的沉積導致其與苯環(huán)共軛體系發(fā)生了一定程度的電子轉移（圖4）。

圖3P(MATIB-co-MBA-co-GMA)(A)和P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP(B)納米粒子的TEM圖片F(xiàn)ig 3 TEM images of P(MATIB-co-MBA-co-GMA)(A)and P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP(B)nanoparticles

圖4A.P(MATIB-co-MBA-co-GMA)納米粒子、P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP納米粒子和FA的FTIR光譜；B.P(MATIB-co-MBA-co-GMA)納米粒子、P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA納米粒子、P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP納米粒子和FA的UV-vis吸收光譜Fig 4 FTIR spectra of P(MATIB-co-MBA-co-GMA)nanoparticles,P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP nanoparticles and FA(A)and UV-vis absorbance spectra of P(MATIB-co-MBA-co-GMA)nanoparticles,P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA nanoparticles,P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP nanoparticles and FA(B)

2.2.3粒徑分析與Zeta電位如表1所示，各步所得納米粒子用激光粒度分析儀測定的水力直徑（Dh）均小于200 nm，且比TEM照片中所得相應納米粒子的平均粒徑（Dn）偏大，這是由于各納米粒子在水溶液中均有一定程度的溶脹所致。同時，各步所得納米粒子在水溶液中均具有較窄的粒徑分布，PDI值由0.002到0.077之間不等，說明所制備的P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子粒徑非常均勻，且在水溶液中具有很好的分散性。從Zeta電位的表征結果可以看出，P（MATIB-co-MBA-co-GMA）納米粒子的 Zeta電位為（-51.3±2.1）mV，這是由于其表面連有大量羧基和環(huán)氧基所致。當與EDA連接后，表面大部分變成了氨基，因而Zeta電位變?yōu)椋?16.2±0.4）mV，明顯正向移動，說明EDA被成功接上。當修飾了FA分子后，其又變?yōu)椋?49.3±1.4）mV，這是由于FA分子有兩個羧基，通常以γ羧基與載體材料相連，而保留游離α羧基，所以Zeta電位又負向移動。

2.3納米粒子的性能表征

2.3.1體外X線衰減性能通過ICP-MS檢測得到P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA納米粒子中的I含量約為 47.9%，P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子中的I含量約為31.9%，Au含量為12.6%（表1）。以不同的I濃度配制一系列兩種納米粒子的溶液，然后進行CT成像，讀取相應的CT值，得到這兩種納米粒子溶液隨碘濃度變化的體外X-射線衰減關系圖（圖5）。可以看出，隨I濃度增大，X-線的衰減能力逐漸增強，沉積了AuNP的納米粒子其CT值明顯高于相同I含量下的P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA納米粒子溶液的CT值，說明AuNP的摻入顯著增強了其CT造影性能。

表1　各步所得納米粒子的粒徑、粒徑分布、Zeta電位、I和Au的含量Tab 1　The size,size distribution,Zeta-potentials and content of I and Au in nanoparticles from every step

圖5P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA納米粒子和P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP納米粒子的I含量與X線衰減關系Fig 5 Relationship of X-ray attenuation with I concentration in P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA nanoparticles and P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNPnanoparticles invitro

2.3.2載藥釋藥性能如圖6A所示，在一定范圍內，P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP 納米粒子的載藥量隨著DOX溶液初始濃度的增加而不斷增大，而包封率則隨著DOX溶液初始濃度的增加而不斷減小。當DOX溶液的初始濃度為1 500 μg/mL時，其載藥量為51.3%，包封率為34.2%。此時納米粒子的載藥量達到飽和，不再隨初始DOX的量的增加而增大。

DOX在不同pH下的釋放曲線如圖6B所示，6 h內釋藥速率較快，之后DOX的釋放速率變得緩慢，48 h后，在pH6.0的PBS溶液中DOX釋放率約為25%，明顯高于在pH 7.4的緩沖溶液中的釋放速率，說明DOX在該納米粒子中的釋放具有一定的pH響應性。

2.3.3細胞吸收及體外靶向性能如圖7所示，分別將終濃度為1 μg/mL的負載DOX的P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子和 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-AuNP納米粒子與人乳腺癌MCF-7細胞孵育0.5 h后，從共聚焦熒光顯微鏡的觀察可以看出，在負載DOX的P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子處理的細胞中可以看到明顯的紅色DOX熒光，說明P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子可以攜載DOX很好地進入細胞，而P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-AuNP納米粒子攜載DOX的入胞能力明顯較差。流式細胞儀的進一步檢測也得到了相同的結果（圖7h），說明經FA修飾的納米粒子對腫瘤細胞具有一定的主動靶向性，其能夠通過受體介導的內吞作用被FA受體高表達的MCF-7細胞更高效地結合和攝取。

圖6A.P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP納米粒子在不同初始濃度DOX溶液時的載藥量和包封率；B.不同pH值時DOX從P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP納米粒子中的釋放Fig 6 The drug loading capacity and encapsulation efficiency of P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP nanoparticles with different initial DOXconcentrations(A)andtheDOXreleasefromP(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNPnanoparticlesunderdifferentpHvalues(B)

圖7MCF-7細胞分別與P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP納米粒子和負載DOX的P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-AuNP納米粒子在37℃孵育0.5 h后的共聚焦熒光顯微鏡照片（a-f）和相關流式細胞儀檢測結果（h）Fig 7 Confocal fluorescence microscope photos(a-f)and the flow cytometry results(h)of untreated MCF-7 cells,P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP nanoparticles and DOX-loaded P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-AuNP nanoparticles incubated with MCF-7 cells at 37℃for 0.5 h

2.3.4細胞毒性本研究采用MTT實驗進一步評估 P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP 納米粒子的細胞毒性及其載藥納米粒子對腫瘤細胞MCF-7的殺傷作用，如圖8所示。可以看出，當P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子濃度低于100 μg/mL時細胞生存活性在80%以上，未顯示出明顯毒性。在載藥納米粒子中，隨DOX濃度增加，負載DOX的P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子和P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-AuNP納米粒子分別處理的MCF-7細胞活性均顯示得到很好的抑制，二者的IC50分別為0.33 μg/mL和0.65 μg/mL。結果表明，有FA修飾的載藥納米粒子顯示出對腫瘤細胞更好的殺傷性能。但相比游離DOX的IC50（0.11 μg/mL），二者對腫瘤細胞的殺傷能力相對較低，這主要是因為DOX在納米粒子中的釋放較慢，在檢測時間內未達到完全釋放。負載DOX的P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子在5 μg/mL的DOX濃度下可殺死約94%的MCF-7細胞，此時納米粒子的濃度約為10μg/mL，納米粒子本身遠不至于產生細胞毒性。這些結果表明，負載DOX的P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子易被MCF-7細胞高效攝取，并在細胞內釋放出DOX發(fā)揮殺傷作用，從而減少對正常組織細胞的傷害。

圖8A.P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP納米粒子對MCF-7細胞的細胞毒性；B.負載DOX的P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP納米粒子、P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-AuNP納米粒子和游離DOX對MCF-7細胞的細胞毒性Fig 8 Relative cellular viability of MCF-7 cells after treatment with P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP nanoparticles(A),DOX loaded P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP nanoparticles,DOX loaded P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-AuNP nanoparticles and free DOX(B)

3　討論

本研究首先制備了含碘單體化合物MATIB，從核磁譜圖確定了其結構。然后采用沉淀聚合法制備了FA修飾并沉積了AuNP的含碘聚合物P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP納米粒子。通過TEM、FT-IR光譜、UV-vis吸收光譜及各步所得納米粒子的粒徑、粒徑分布、Zeta電位、I和Au的含量確定了P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FAAuNP納米粒子的結構和表面形貌。通過納米粒子溶液隨碘濃度變化的體外X-射線衰減關系圖可以看出 P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP 納米粒子具有較好的X線衰減效應，并優(yōu)于沒有AuNP摻雜的納米粒子，說明AuNP的摻入顯著增強了其CT造影性能。載藥和釋藥結果表明，該納米粒子對DOX的負載量可達到51.3%，并具有pH響應的藥物釋放性能。通過共聚焦熒光顯微鏡和流式細胞儀的觀察，可以得知該納米粒子對MCF-7腫瘤細胞具有一定的主動靶向性，其能夠通過受體介導的內吞作用被FA受體高表達的MCF-7細胞更高效地結合和攝取。細胞毒性表征結果顯示，該納米粒子具有較低的細胞毒性，并可以高效攜載抗腫瘤藥物進入腫瘤細胞并殺死腫瘤細胞。

綜上結果，本研究制備的P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子顯示了可同時作為X線CT造影劑和抗腫瘤藥物輸送載體的能力，有潛力成為腫瘤診治一體化的診療劑。

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