腰臀比性狀的全基因組通路關聯分析研究

張苗苗 ，Struan Grant，Hakon Hakonarson，R.Arlen Price，張 愿 ，李衛東 ，焦紅肖

（1.天津醫科大學遺傳學系，天津300070；2.美國費城兒童醫院應用基因組學中心，費城PA 19104；3.美國賓夕法尼亞大學醫學院精神醫學系，費城PA 19104；4.天津醫科大學基礎醫學研究中心，天津300070）

腰臀比（waist to hip ratio,WHR）反映人體腹部皮下脂肪及內臟脂肪的聚集程度，是判斷中心性肥胖的重要測量標準。最近研究表明，人體脂肪分布是一種重要的代謝健康量度，不同的脂肪分布與不同的代謝風險相關[1]。腰圍（waist circumference,WC）與腰臀比作為判定中心性肥胖的測量指標是高度遺傳的[2]。多個影響腰臀比的常見遺傳變異位點已經通過全基因組關聯分析研究（Genome-wide association study，GWAS）確認。Lindgren 等[3]確認 2個與WC相關的基因位點（TFAP2B和MSRA）及1個在女性中與WHR相關的基因位點（LYPLAL1）。Heid等[4]在歐洲人群中確認了14個基因位點與脂肪分布相關，其中包括已經確認的LYPLAL1基因。WHR作為復雜性狀，由多種基因控制。傳統的GWAS由于其有限的檢測效能，一些與WHR相關的微效基因在多重檢驗校正后變得不顯著，同時也忽略了基因之間的交互作用，致使一些利用GWAS篩選出來的基因不足以解釋WHR性狀的較高遺傳度[4]。為了彌補傳統GWAS的不足，許多新的分析方法應運而生，Wang等[5]在基因集合富集分析GSEA（Gene Set Enrichment Analysis）算法的基礎上開發出應用于GWAS數據進行全基因組通路關聯分析的方法GenGen[6]。本研究采用GenGen軟件檢測與WHR相關的基因集合/通路，通過已有的生物學通路知識確定與WHR相關的基因集合/通路，為挖掘WHR候選基因提供一定的科學依據。

1　資料與方法

1.1研究對象本研究收集1 071名無血緣關系的歐洲裔美國人作為研究對象，其中526名極度肥胖者 （BMI＞35 kg/m2），545 名體質量正常者（BMI＜25 kg/m2且一生中未超過25kg/m2）。極度肥胖者全部選自肥胖三聯體和肥胖家系中的先證者。肥胖三聯體要求父母雙方至少有一個正常；肥胖家系要求同時具備肥胖同胞對和正常-肥胖同胞對。選取正常體質量者與極度肥胖者間無血緣關系，且匹配性別、年齡和地理分布。研究對象中，1 058例樣本含有腰圍/臀圍資料，其中女性1017例，男性41例。調查取樣均已征得本人同意并簽署知情同意書，該研究獲得美國賓夕法尼亞大學人類研究委員會批準。

1.2腰臀比分組腰臀比病例/對照分析時，根據1999年世界衛生組織WHO對中心性肥胖的診斷定義，將 WHR:男＞0.90，女＞0.85 樣本作為病例組，WHR:男≤0.90，女≤0.85樣本作為對照組。

1.3方法

1.3.1提取全基因組DNA采用高鹽法獲取人外周血全基因組DNA，紫外分光光度計測定DNA濃度及純度確保質量，DNA樣本于-80℃保存。

1.3.2基因分型及質量控制采用Illumina公司Illumina HumanHap 550 SNP array對大約55萬個SNP位點進行基因分型，其中剔除次等位基因頻率（MAF）小于0.01或哈迪-溫伯格平衡（HWE）檢測值小于0.001的SNP位點，共計約518 230個SNPs，17 437個基因，基因分型結果保存于Illumina BeadStudio 3.0進行整理。

1.4統計學分析應用SPSS17.0軟件對樣本表型資料進行統計學描述。運用GenGen軟件對全基因組約55萬個SNP位點進行腰臀比二分類變量（病例/對照）全基因組通路關聯分析，運算方法如下：（1）經χ2檢驗確定病例/對照試驗中每一個SNP位點對應χ2值，選取每個基因內SNP位點最大χ2值作為該基因的統計值；（2）利用GSEA運算法則計算基因集/通路 S 富集值 ES（S）；（3）為了調整不同基因的大小和同一基因內不同SNP位點之間的連鎖不平衡，進行以下校正：①隨機對樣本進行1 000次表型重排（每次重排后病例/對照組樣本量不變），計算每次重排后相應富集值 ES（S，π），②根據1 000次表型重排富集值計算標準化富集值NES，NES=[ES（S）-mean(ES(S,π))]/SD[ES(S,π)]，從而不同基因集/通路S間可進行比較；（4）計算實驗P值（empirical P），重排后 ES（S，π）值大于實際 ES（S）值的次數的百分比即為實驗P值；（5）對所得結果進行多重假設檢驗，其中假陽性發現率（false-discovery rate，FDR）用來控制預期的假陽性發現比例小于一定閾值，參照Aravind等[7]的GSEA法分析研究，本次研究FDR顯著性標準設定為FDR≤0.25。

2　結果

2.1WHR基本特征描述本研究共納入研究對象1 058例，其中病例組700例，對照組358例，對照組與病例組間WHR水平差異顯著（P＜0.0001），見表1。

表1　病例/對照組WHR特征描述Tab 1　Traits distributions of WHR in cases and controls

2.2統計結果分析通過對腰臀比性狀在約55萬個SNP位點、1 347條通路/基因集合中全基因組通路關聯分析研究發現：65條通路/集合達到顯著水平（P＜0.05），其中3條通路經多重檢驗校正后FDR≤0.25。如圖1、表2所示。在65條通路/集合中，rasPathway（Ras信號通路）最為顯著（empirical P=0.003，FDR=0.238）。另外，ceramidePathway（神經酰胺信號通路）和hcmvPathway（人巨細胞病毒與MAPK通路）是另外兩條結果顯著的通路（分別為empirical P=0.004，FDR=0.196、empirical P=0.005，FDR=0.203）。如表3所示，Ras信號通路包含23個基因，其下游分支PI3K/AKT途徑相關基因BAD、AKT1、PIK3CA、PIK3CG、PIK3R1；MAPK/ERK 途 徑相關基因 RAF1、MAP3K1、MAPK1、MAPK3、MAP2K1和IKKβ/NF-κB途徑相關基因NFKB1和RELA等均廣泛分布于與WHR性狀相關的ceramidePathway和hcmvPathway中，提示rasPathway基因集合與WHR性狀可能存在一定的關聯性。

圖1　WHR（case/control）通路分析empirical P值分布圖Fig 1 Distribution of empirical P value of WHR related pathways in cases and controls

表2　WHR（case/control）顯著相關通路Tab 2　Significant pathways of WHR in cases and controls

表3　信號通路基因集合Tab 3　Gene set of pathways

3　討論

脂肪中心性積累與一系列的疾病如糖尿病、高血壓和心臟病等相關[8-10]，其關聯性甚至超出了廣義肥胖[11]。研究發現[12]，腹部肥胖者脂肪在腹腔內臟分布，內臟脂肪的聚集及分泌代謝多種細胞因子進入循環系統，包括IL-6、TNF-α、脂聯素、瘦素等，導致一系列代謝異常，如胰島素抵抗、血脂代謝異常、糖調節受損、慢性炎癥反應等。1999年WHO將中心性肥胖（WHR:男＞0.90，女＞0.85 和（或）BMI＞30 kg/m2）作為代謝綜合征MS的診斷標準之一。2005年，國際糖尿病聯盟工作組IDF將中心性肥胖作為MS的必要診斷條件。作為一項重要的臨床指標，復雜性狀WHR群體水平的遺傳學研究具有深刻的意義。本研究中，利用改良后的基因集合富集分析法對復雜性狀WHR進行全基因組通路關聯分析，研究發現Ras信號通路與WHR顯著相關，其下游分支PI3K/AKT途徑、MAPK/ERK途徑和NF-κB途徑位于多條與WHR相關的通路中，如神經酰胺信號通路和人巨細胞病毒與MAPK通路，提示Ras信號通路基因集合與WHR性狀存在一定的關聯性。

PI3K/AKT途徑和MAPK/ERK途徑及其它們的下游途徑NF-κB途徑影響細胞內多種生物學功能，如細胞增殖、凋亡、細胞遷徙、細胞周期、免疫炎癥等。PI3K/AKT途徑是胰島素信號通路中的經典途徑，胰島素主要通過PI3K途徑介導胰島素對葡萄糖、蛋白質及脂肪代謝的調控作用。最近的研究發現胰島素和瘦素信號可通過 PI3K/AKT、Foxo1、MAPK和mTOR通路相互作用共同調節能量代謝。MAPK/ERK途徑同樣與細胞的增殖、分化和凋亡相關，并參與炎癥、腫瘤等疾病的發生。NF-κB途徑作為PI3K/AKT途徑和MAPK/ERK途徑的下游分支，可調控多種炎癥因子的表達，在細胞凋亡、免疫、炎癥等生物學進程中發揮作用。Zhang等[13]證實下丘腦內側基底部的IKKβ/NF-κB途徑激活可導致中央胰島素和瘦素抵抗。Yuan等[14]研究發現炎癥反應和IKKβ/IκB/NF-κB途徑激活是造成肥胖和飲食誘導的胰島素抵抗的主要原因。整體、器官和組織對胰島素作用的反應性降低，可促進肌肉、脂肪等外周組織攝取和利用葡萄糖，抑制肝糖輸出，促進糖原與脂肪的合成，造成一系列代謝紊亂。越來越多的證據表明外周組織的脂肪累積與肥胖和2型糖尿病中發現的胰島素抵抗相關。在之前的通路關聯研究中，我們已經證實Ras信號通路與歐洲裔美國人群中血漿脂聯素水平相關[15]。人體脂聯素水平與糖尿病、肥胖呈負相關，在人體內具有廣泛的調節功能，可促進脂肪酸氧化、增強葡萄糖攝取和改善胰島素抵抗等，提示Ras信號通路中PI3K/AKT途徑和MAPK/ERK途徑及其它們的下游途徑NF-κB途徑可能借助脂聯素、胰島素等信號進行一系列代謝調控，造成糖代謝紊亂，脂肪合成增加與代謝減少，造成腹部脂肪累積，進而影響腰臀比。

總之，本研究利用全基因組通路關聯分析全面展示了與復雜性狀WHR相關的通路網絡，提示Ras信號通路可能與歐洲裔美國人群中復雜性狀腰臀比具有關聯。我們準備擴大樣本量進一步驗證，并進行相關的功能性研究。

參考文獻：

[1]Booth A,Magnuson A,Foster M.Detrimental and protective fat:body fat distribution and its relation to metabolic disease[J].Horm Mol Biol Clin Investig,2014,17(1):13

[2]Schleinitz D,B?ttcher Y,Blüher M,et al.The genetics of fat distribution[J].Diabetologia,2014,57(7):1276

[3]Lindgren C M,Heid I M,Randall J C,et al.Genome-wide association scan meta-analysis identifies three Loci influencing adiposity and fat distribution[J].PLoS Genet,2009,5(6):e1000508

[4]Heid I M,Jackson A U,Randall J C,et al.Meta-analysis identifies 13 new loci associated with waist-hip ratio and reveals sexual dimorphisminthegeneticbasisoffatdistribution[J].NatGenet,2010,42(11):949

[5]Lai Y,Zhang F,Nayak T K,et al.Concordant integrative gene set enrichment analysis of multiple large-scale two-sample expression data sets[J].BMC Genomics,2014,15(Suppl 1):S6

[6]Wang K,Li M,Bucan M.Pathway-based approaches for analysis of genomewideassociationstudies[J].AmJHumGenet,2007,81(6):1278

[7]Subramanian A,Tamayo P,Mootha V K,et al.Gene set enrichment analysis:a knowledge-based approach for interpreting genomewide expression profiles[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2005,102(43):15545

[8]Khan A,Faheem M,Shah S T,et al.Frequency of abdominal obesity anditsassociationwithdiabetesmellitusamongpeopleofpeshawar[J].J Ayub Med Coll Abbottabad,2015,27(3):617

[9]De Oliveira C M,Ulbrich A Z,Neves F S,et al.Association between anthropometric indicators of adiposity and hypertension in a Brazilian population:Baependi Heart Study[J].PLoS One,2017,12(10):e0185225

[10]Keihani S,Hosseinpanah F,Barzin M,et al.Abdominal obesity phenotypes and risk of cardiovascular disease in a decade of followup:the Tehran Lipid and Glucose Study[J].Atherosclerosis,2015,238(2):256

[11]Myint P K,Kwok C S,Luben R N,et al.Body fat percentage,body mass index and waist-to-hip ratio as predictors of mortality and cardiovascular disease[J].Heart,2014,100(20):1613

[12]Reilly M P,Rader D J.The metabolic syndrome:more than the sum of its parts[J].Circulation,2003,108(13):1546

[13]Zhang X Q,Zhang G,Zhang H,et al.Hypothalamic IKK beta/NF-kappa B and ER stress Link overnutrition to energy imbalance and obesity[J].Cell,2008,135(1):61

[14]Yuan M,Konstantopoulos N,Lee J,et al.Reversal of obesity-and diet-induced insulin resistance with salicylates or targeted disruption of Ikkbeta[J].Science,2001,293(5535):1673

[15]Li W D,Jiao H,Wang K,et al.Pathway-Based genome-wide association studies reveal that the Rac1 pathway is associated with plasma adiponectin levels[J].Sci Rep,2015,5:13422