鞘內注射賽庚啶緩解小鼠骨癌痛

杭黎華，衛世有，徐振鍇，蔡玥嬌，李姝娜，彭生

（1.江蘇大學附屬昆山醫院麻醉科，江蘇昆山215300；2.上海交通大學醫學院附屬新華醫院耳鼻喉科，上海200092；3.上海中醫藥大學附屬第七人民醫院麻醉科，上海200137）

SET domain containing lysine methyltransferase 7／9（SET7／9）是組蛋白 H3賴氨酸4甲基轉移酶，可使NF-κB、STAT3等轉錄因子甲基化，調控基因轉錄［1－2］。離體研究證實，SET7／9可通過激活 NF-κB p65，促進炎癥基因的表達及炎性因子的產生［3］。多項研究證實，炎性因子與骨癌痛的產生存在著密切聯系［4－5］。但是，SET7／9是否參與骨癌痛的發生目前并不明確。因此，本研究擬采用行為學實驗、藥理學及蛋白質印跡等方法來探討SET7／9在小鼠骨癌痛中的作用。

1　材料與方法

1.1　動物及分組

雄性C3H／HeJ小鼠88只，體質量20～25 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司（許可證號：SCXK2016-0001）。小鼠自由飲水、攝食，所有動物實驗符合江蘇大學實驗動物倫理委員會的要求。實驗分2部分：第1部分實驗分為假手術組和骨癌痛組，每組8只小鼠；造模后觀察骨癌痛小鼠機械痛敏閾值（paw withdrawlmechanical threshold，PWMT）及SET7／9在骨癌痛小鼠脊髓背角中的表達變化。第2部實驗分為假手術組、骨癌痛組、骨癌痛＋賽庚啶10 nmol組、骨癌痛＋賽庚啶20 nmol組、骨癌痛＋SET7／9 0.2μg組、骨癌痛 ＋SET7／9 0.2μg＋賽庚啶20 nmol組（鞘內注射SET7／9 30 min后鞘內注射賽庚啶）、骨癌痛＋氯苯那敏200μg組，每組8只小鼠；觀察鞘內注射賽庚啶對骨癌痛小鼠痛行為學及脊髓背角SET7／9表達的影響。

1.2　小鼠骨癌痛模型的建立

按Schwei等［6］報道的方法建立小鼠骨癌痛模型。將保存于液氮罐中的NCTC 2472纖維肉瘤細胞株（美國ATCC公司）取出，迅速37℃水浴復蘇，然后將其注入有培養基的離心管中，20℃低速離心5 min。細胞沉淀用培養基適當稀釋后，在37℃含5%CO2的培養箱中培養。收集處于對數生長期的細胞，用α-MEM培養基懸浮腫瘤細胞，調整密度至1×107／mL，置于冰上備用。腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg／kg）麻醉小鼠后，在左膝關節處做一個長0.5～1 cm的皮膚切口，顯露股骨平臺；用牙科鉆沿股骨長軸方向鉆孔進入股骨骨髓腔，抽取NCTC 2472腫瘤細胞懸液20μL（2×105個），由鉆孔向骨髓腔中緩慢注入。注射完畢后立即采用牙科汞合金封堵穿刺孔，最后縫合切口。

預實驗中通過行為學、影像學及病理學等證實，該方法制模成功率在95%左右。本研究通過觀察骨癌痛小鼠PWMT，證實納入研究的樣本均制模成功。假手術組小鼠于股骨骨髓腔注射生理鹽水20 μL。第二部分實驗于制模手術后15 d進行鞘內注射給藥。

1.3　小鼠鞘內藥物注射

SET7／9抑制劑賽庚啶及氯苯那敏購自上海Sigma-Aldrich公司；SET7／9蛋白為 Abcam公司產品。賽庚啶、氯苯那敏及 SET7／9均參照 Hylden等［7］的方法進行鞘內給藥。右手持25μL微量注射器與脊柱上方成20°角于L5～6間隙進針，以鼠尾出現突然側向運動為成功標志；緩慢注藥，注射時間為5 s，劑量為5μL，留針10 s。預實驗中，給10只小鼠鞘內注射2%利多卡因，每只5μL，小鼠均出現雙后肢癱瘓，而雙前肢運動正常，阻滯持續10～20 min后，雙下肢活動恢復正常，表明鞘內注射部位正確。

1.4　小鼠機械痛敏閾值的檢測

采用von Frey纖毛測定小鼠PWMT［8］。小鼠于測試籠中適應30 min，采用對數級數的von Frey纖毛垂直刺激小鼠左后肢足底中部，當小鼠出現快速縮足或甩足時為陽性反應，用 up-down法［9］計算50%縮足閾值。第1部分實驗檢測術前1 d及術后5、7、12、15 d假手術組與骨癌痛組小鼠 PWMT；第2部分實驗檢測鞘內給藥前（0 h）及鞘內給藥后1、3、6 h各組PWMT。

1.5　蛋白質印跡法檢測小鼠脊髓SET7／9的表達

鞘內注射賽庚啶組脊髓背角取材時間為鞘內注射后6 h。第一部分實驗假手術組、骨癌痛組及第二部分實驗骨癌痛組、骨癌痛＋賽庚啶20 nmol組小鼠深麻醉后斷頸處死（n＝4），冰上取小鼠左側脊髓背角L4～6節段。溶解于裂解液中，4℃，15 000×g離心15 min，取上清液。SDS-PAGE膠垂直電泳分離蛋白，PVDF轉膜45 min，5%脫脂奶粉溶液與室溫孵育1 h；PBST洗膜3次，每次10 min；小鼠抗SET7／9（1∶1 000，Abcam公司）、β-肌動蛋白（1∶5 000，Sigma公司）4℃孵育過夜；辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠二抗（1∶500，碧云天生物技術公司）室溫孵育1 h；滴加化學發光液反應 1 min，吸干膜上的水分，暗室曝光，圖片掃描。Image J軟件對圖片進行灰度分析。

1.6　統計學分析

采用SPSS 17.0統計學軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示。行為學數據采用重復測量的方差分析，蛋白質印跡實驗數據采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1　骨癌痛小鼠痛行為學改變

兩組小鼠在15 d的觀察期限內健康狀況良好，兩組小鼠術前1 d的PWMT差異無統計學意義（P＞0.05）。與假手術組比較，骨癌痛組手術后7，12，15 d PWMT明顯降低（P＜0.05或 0.01）；與術前1 d相比，骨癌痛組術后7，12，15 d的PWMT逐漸降低（P＜0.05或0.01）。見表1。

表1　兩組小鼠機械痛敏閾值的變化g，±s，n＝8

表1　兩組小鼠機械痛敏閾值的變化g，±s，n＝8

a：P＜0.05，b：P＜0.01，與術前1 d比較

手術后5 d　7 d　12 d　15 d假手術組　1.93±0.51　1.83±0.49　1.90±0.52　1.87±0.49　1.8組別　術前1 d 7±0.48骨癌痛組　1.87±0.48　1.85±0.47　1.38±0.46a　0.83±0.28b　0.51±0.21b t值0.417　0.379　0.032　0.007　0.003 0.697　0.821　5.607　9.773　12.851 P值

2.2　骨癌痛小鼠脊髓背角SET7／9的表達

蛋白質印跡結果顯示，術前1 d假手術組和骨癌痛組小鼠脊髓背角SET7／9的表達差異無統計學意義（P＞0.05）；與術后15 d假手術組或自身術前1 d相比，術后15 d骨癌痛組小鼠脊髓背角SET7／9的表達水平顯著增加（P＜0.01）。見圖1。

圖1　骨癌痛小鼠脊髓背角SET7／9表達變化

2.3　鞘內注射賽庚啶對造模后15 d小鼠痛行為學及脊髓背角SET7／9表達的影響

由表2可見，鞘內注射前（0 h）骨癌痛各組的PWMT均明顯低于假手術組（P＜0.05）；鞘內注射賽庚啶10、20 nmol呈劑量依賴性地增加造模手術后15 d骨癌痛小鼠的PWMT，在鞘內注射賽庚啶3 h后PWMT值達最高。與鞘內注射前0 h相比，骨癌痛 ＋SET7／9 0.2μg組、骨癌痛 ＋SET7／9 0.2μg＋賽庚啶20 nmol組及骨癌痛＋氯苯那敏200μg組在鞘內給藥后1，3，6 h的PWMT均無明顯變化（均 P＞0.05）。

與骨癌痛組相比，骨癌痛＋賽庚啶20 nmol組小鼠在鞘內給藥6 h后脊髓背角SET7／9表達明顯降低（P＜0.01）。見圖2。

表2　鞘內注射賽庚啶對造模手術后15 d骨癌痛小鼠機械痛敏閾值的變化g，±s，n＝8

表2　鞘內注射賽庚啶對造模手術后15 d骨癌痛小鼠機械痛敏閾值的變化g，±s，n＝8

a：P＜0.05，與同時間點假手術組比較；b：P＜0.05，與同時間點骨癌痛組比較；c：P＜0.05，與自身鞘內注射前0 h比較

組別　鞘內注射前0 h 1 h　3 h　6 h　F值　P值鞘內注射后假手術組　1.87±0.48　1.81±0.44　1.82±0.51　1.85±0.53　2.891　0.901骨癌痛組　0.50±0.18a　0.54±0.16a　0.52±0.17a　0.50±0.15a　3.142　0.974骨癌痛 ＋賽庚啶10 nmol組　0.53±0.19a　0.55±0.18a　0.96±0.24a，b，c　0.54±0.17a　3.443　0.043骨癌痛 ＋賽庚啶20 nmol組　0.51±0.17a　0.89±0.23a，b，c 1.53±0.41b，c　0.55±0.16a　4.761　0.001骨癌痛 ＋SET7／9 0.2μg組　0.52±0.17a　0.51±0.16a　0.53±0.17a　0.52±0.15a　2.761　0.837骨癌痛 ＋SET7／9 0.2μg＋賽庚啶20 nmol組　0.51±0.18a　0.54±0.18a　0.58±0.18a　0.52±0.16a　3.004　0.887骨癌痛 ＋氯苯那敏200μg組　0.52±0.18a　0.52±0.14a　0.53±0.14a　0.52±0.14a　2.998　0.864 F值3.681　4.207　4.539　3.740 P值0.004　0.001　0.000　0.003

圖2　鞘內注射賽庚啶對骨癌痛小鼠脊髓SET7／9表達的影響

3　討論

表觀遺傳學是指基于非基因序列改變所致基因表達水平的變化，即通過組蛋白修飾、DNA甲基化及非編碼 RNA調控等方式對基因的表達進行調控［10］。組蛋白修飾包括甲基化、乙酰化、磷酸化等。研究表明，表觀遺傳學參與慢性疼痛的調控過程［11］。SET7／9是催化染色質組蛋白H3K4單甲基化的關鍵酶。Laumet等［12］研究發現，在神經病理性疼痛模型中，組蛋白甲基轉移酶G9a在背根神經節中表達明顯增加，鞘內注射G9a抑制劑UNC0638可明顯減輕小鼠的痛覺過敏。本研究結果顯示，骨癌痛小鼠脊髓背角SET7／9的表達顯著增加，鞘內注射SET7／9抑制劑賽庚啶可明顯減輕小鼠骨癌痛且顯著降低脊髓背角SET7／9的表達水平，提示SET7／9可能參與小鼠骨癌痛的發展過程。

本實驗中發現，鞘內注射賽庚啶20 nmol可明顯緩解小鼠骨癌痛，鞘內預先注射SET7／9 0.2μg對骨癌痛小鼠痛行為學沒有影響，但卻可抵消20 nmol賽庚啶緩解骨癌痛的作用，提示SET7／9在骨癌痛中起重要作用。預實驗中，我們發現鞘內注射賽庚啶60 nmol對自主小鼠的痛行為學沒有明顯影響，故本實驗中選擇賽庚啶10、20 nmol鞘內注射，應可排除賽庚啶本身的藥理作用對小鼠痛行為學的干擾，使實驗結果更為可靠。這一觀察結果與Suh等［13］的研究相似，該研究證實鞘內注射賽庚啶0.31～62 nmol對自主小鼠痛行為學沒有影響。鞘內注射是研究藥物作用于脊髓的好方法［7］，但鞘內注射賽庚啶不可避免地也可作用于背根神經節。因此，本研究結果顯示賽庚啶可減輕骨癌痛，也可能包含背根神經節SET7／9參與骨癌痛的外周機制。賽庚啶除了對SET7／9有抑制作用外，還有潛在的拮抗H1受體的作用。研究發現，鞘內注射足量拮抗H1受體作用的氯苯那敏 200μg［14］，對骨癌痛小鼠痛行為學沒有明顯影響，提示賽庚啶減輕骨癌痛主要是通過抑制SET7／9。綜上所述，脊髓SET7／9可能參與小鼠骨癌痛的發展過程。

［參考文獻］

［1］Takemoto Y，Ito A，Niwa H，et al.Identification of cyproheptadine as an inhibitor of SET domain containing lysinemethyltransferase 7／9（Set7／9）that regulates estrogen-dependent transcription［J］.JMed Chem，2016，59（8）：3650－3660.

［2］Son MJ，Kim WK，Park A，et al.Set7／9，a methyltransferase，regulates the thermogenic program during brown adipocyte differentiation through themodulation of p53 acetylation［J］.Mol Cell Endocrinol，2016，431：46－53.

［3］Li Y，Reddy MA，Miao F，etal.Role of the histone H3 lysine 4 methyltransferase，SET7／9，in the regulation of NF-κB-dependent inflammatory genes.Relevance to diabetes and inflammation［J］.J Biol Chem，2008，283（39）：26771－26781.

［4］Zhou YQ，Liu Z，Liu ZH，et al.Interleukin-6：an emerging regulator of pathological pain［J］.J Neuroinflammation，2016，13（1）：141.

［5］Lu C，Liu Y，Sun B，et al.Intrathecal injection of JWH-015 attenuates bone cancer pain via time-dependentmodification of pro-inflammatory cytokines expression and astrocytes activity in spinal cord［J］.Inflammation，2015，38（5）：1880－1890.

［6］Schwei MJ，Honore P，Rogers SD，etal.Neurochemical and cellular reorganization of the spinal cord in amurine model of bone cancer pain［J］.J Neurosci，1999，19（24）：10886－10897.

［7］Hylden JL，Wilcox GL.Intrathecal morphine in mice：a new technique［J］.Eur J Pharmacol，1980，67（2／3）：313－316.

［8］Hang LH，Li SN，Dan X，et al.Involvement of spinal CCR5／PKCγsignaling pathway in the maintenance of cancer-induced bone pain［J］.Neurochem Res，2017，42（2）：563－571.

［9］Dixon WJ.Efficient analysis of experimental observations［J］.Annu Rev Pharmacol Toxicol，1980，20：441－462.

［10］Song Y，Wu F，Wu J.Targeting histonemethylation for cancer therapy：enzymes，inhibitors，biological activity and perspectives［J］. J Hematol Oncol，2016，9（1）：49.

［11］Liang L，Lutz BM，Bekker A，et al.Epigenetic regulation of chronic pain［J］.Epigenomics，2015，7（2）：235－245.

［12］Laumet G，Garriga J，Chen SR，et al.G9a is essential for epigenetic silencing of K＋channel genes in acute-tochronic pain transition［J］.Nat Neurosci，2015，18（12）：1746－1755.

［13］Suh HW，Chung KM，Kim YH，et al.Effects of histamine receptor antagonists injected intrathecally on antinociception induced by opioids administered intracerebroventricularly in themouse［J］.Neuropeptides，1999，33（2）：121－129.

［14］Zhang L，Jiang GY，Song NJ，et al.Extracellular signal-regulated kinase（ERK）activation is required for itch sensation in the spinal cord［J］.Mol Brain，2014，7：25.