三種金黃色葡萄球菌選擇性分離培養基的檢測效果比較

顧其芳 張紅芝 朱穎瑩 魯珺琰 於穎 劉誠 劉玥 陳敏

摘要：【目的】比較三種金黃色葡萄球菌選擇性分離培養基的檢測效果?！痉椒ā糠謩e使用Baird-Parker培養基（BP）、兔血漿纖維蛋白原培養基（RPF）和科瑪嘉葡萄球菌顯色培養基（CHROMagarTMStaph aureus）對標準菌株、食品分離株以及食品樣品進行對比檢測?！窘Y果】三種選擇性培養基對金黃色葡萄球菌的回收率均達到95%以上；RPF和CHROMagarTMStaph aureus培養基的檢測效率明顯高于BP培養基；且兩種培養基敏感性、特異性均優于傳統的BP培養基?！窘Y論】應用RPF和CHROMagarTMStaph aureus培養基檢測食品中金黃色葡萄球菌，較傳統的BP培養基具有更好的檢測效果，建議將RPF和CHROMagarTMStaph aureus培養基作為可靠的分離檢測培養基應用于食品中金黃色葡萄球菌的分離檢測。

關鍵詞：金黃色葡萄球菌；Baird-Parker培養基；兔血漿纖維蛋白原培養基（RPF）；科瑪嘉葡萄球菌顯色培養基；檢測效果

中圖分類號：R195 文獻標志碼：A DOI：10.19428/j.cnki.sjpm.2018.18378

引用格式：顧其芳，張紅芝，朱穎瑩，等.三種金黃色葡萄球菌選擇性分離培養基的檢測效果比較[J].上海預防醫學，2018，30（1）：69-73.

Detection effects compared between three types of selective media for Staphylococcus aureus GU Qi-fang，ZHANG Hong-zhi，ZHU Ying-ying，LU Jun-yan，YU Ying，LIU Cheng，LIU Yue，CHEN Min（Shanghai Municipal Center for Disease Control and Prevention，Shanghai 200336，China）

Abstract： [Objective] To compare the detection effects between three kinds of selective media for Staphylococcus aureus. [Methods] Baird-Parker （BP） agar，Rabbit Plasma Fibrinogen （RPF） agar and CHROMagarTMStaph aureus were selected to test the standard strains，food-isolated strains as well as food samples. [Results] More than 95% recovery efficiency could be reached by utilization of all the three types of media. However，the detection effects of RPF and CHROMagarTMStaph aureus were significantly higher than that of BP agar.Moreover，their sensitivity and specificity were also superior to that of conditional BP agar. [Conclusion] Better detection effect is obtained from RPF and CHROMagarTMStaph aureus when compared to that from BP agar，suggesting that RPF and CHROMagarTMStaph aureus agar are more reliable for the detection of Staphylococcus aureus in food.

Keywords：Staphylococcus aureus；Baird-Parker agar；Rabbit Plasma Fibrinogen agar（RPF）；CHROMagarTMStaph aureus；detection effect

金黃色葡萄球菌是引起人類食源性疾病的重要病原菌之一，對其的微生物檢測方法目前仍以常規分離培養為主。GB 4789.10—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》規定Baird-Parker培養基（BP）為唯一使用的選擇性培養基[1]。它也是目前國內實驗室最多采用的分離培養基，但此培養基不能檢測出對卵黃反應陰性的金黃色葡萄球菌，其特異性不高。因此需要補充包括革蘭氏染色、鏡檢、凝固酶等試驗才能確認[2]。而在國外，一種利用凝固酶陽性的葡萄球菌可將兔血漿纖維蛋白原培養基（RPF）中的纖維蛋白原分解為不溶性蛋白，使菌落外圍出現沉淀暈環，直接可以對凝固酶陽性的金黃色葡萄球菌進行分離確認的技術被廣泛使用[3-5]。另外，20世紀90年代后期開發應用的顯色培養基技術通過觀察菌落顏色對菌株進行分離鑒定，也是對傳統檢測手段的一個突破[6-7]。由于金黃色葡萄球菌是重要的食源性致病菌，而培養基的選擇又是檢驗工作的關鍵，因此本研究采用標準菌株、食品分離株及各類食品樣品，比較BP、RPF及CHROMagarTMStaph aureus三種培養基對金黃色葡萄球菌分離培養的檢測效果進行初步評價。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 標準菌株： 金黃色葡萄球菌ATCC6538及金黃色葡萄球菌ATCC25923；實驗室保存菌株：食品中分離的金黃色葡萄球菌菌株40 株，非金黃色葡萄球菌菌株50株。以上菌株均由上海市疾病預防控制中心菌種室提供。

1.1.2 培養基和試劑 RPF培養基（貨號：44003）、凍干兔血漿（貨號：55181）由法國生物梅里埃公司提供；CHROMagarTMStaph aureus培養基（貨號：CP60015 ）由鄭州人福博賽生物技術有限責任公司提供；BP培養基（貨號：CMD023）、胰胨大豆（TSA）培養基（貨號：CMD027）、血瓊脂培養基（貨號：CMD002）、7.5%氯化鈉肉湯（貨號：CMA058）、牛肉湯（貨號：CMA001）由上海市疾病預防控制中心提供。

1.1.3 樣品來源 2017年1月—4月在上海市食品超市、農貿市場采集的調理肉制品、熟肉制品、生牛奶等食品共計243份，經冷鏈送達實驗室。

1.2 方法

1.2.1 選擇性培養基目標菌株回收率、檢測效率測試 回收率是選擇性培養基分離效果的重要指標。本研究根據GB 4789.10—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》對于目標菌回收率測定要求，選用金黃色葡萄球菌ATCC6538、ATCC25923菌株，經血瓊脂培養基純培養后挑取單個菌落轉種（36±1）℃牛肉湯增菌過夜，將此增菌液用無菌生理鹽水調成0.5麥氏濃度菌懸液，并10倍梯度稀釋至10-8，選擇10-5、10-6、10-7稀釋度的菌懸液，每個稀釋度分別吸取1 mL樣品混勻液以0.3、0.3、0.4 mL接種量分別加入3塊BP、RPF、CHROMagarTMStaph aureus、TSA培養基[8]，然后用無菌涂布棒涂布整個培養基，于36℃培養48 h后計數。各種選擇性瓊脂與TSA培養基的菌落數的比值，即為選擇性培養基的回收率。同時觀察菌株在18 h、24 h、48 h生長情況并記錄。各培養基預期的典型菌落形態： RPF培養基呈黑色、灰色或白色，外圍有沉淀暈環的菌落；CHROMagarTMStaph aureus培養基呈紫紅色至粉紅色菌落；BP培養基呈灰黑色至黑色，周圍繞以不透明圈（沉淀）菌落。

1.2.2 選擇性培養基敏感性、特異性測試 選取上海市疾病預防控制中心菌種室提供的金黃色葡萄球菌食品分離株40株、非金黃色葡萄球菌菌株50株，經血瓊脂培養基純培養后挑取單個菌落轉種（36±1）℃牛肉湯增菌過夜，用無菌生理鹽水調整測試菌液濃度0.5 MCF，取0.01 mL菌液分別加入至RPF培養基、BP培養基和CHROMagarTMStaph aureus培養基，用接種環劃線接種，置（36±1）℃培養，觀察培養基單個菌落生長情況。各培養基上出現符合典型金黃色葡萄球菌菌落生長的菌株數與已經鑒定是金黃色葡萄球菌菌株數的比值即為選擇性培養基的敏感性；各培養基上出現不符合典型金黃色葡萄球菌菌落生長的菌株數與已經鑒定是非金黃色葡萄球菌菌落數的比值為選擇性培養基的特異性。

1.2.4 食品樣品檢測方法 樣品增菌方法參照GB 4789.10—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》規定的方法，增菌后分別劃線接種RPF和CHROMagarTMStaph aureus培養基置（36±1）℃培養24 h，BP培養基置（36±1）℃培養48 h，挑取可疑菌落進行鑒定。

1.2.5 菌株鑒定 通過挑取不同的選擇性培養基上的可疑菌落進行染色鏡檢、溶血試驗和血漿凝固酶試驗，符合金黃色葡萄球菌特征，以此確認為金黃色葡萄球菌檢出陽性。

2 結果

2.1 選擇性培養基目標菌株的回收率

金黃色葡萄球菌ATCC6538、ATCC25923菌株在BP 、RPF、CHROMagarTMStaph aureus培養基回收率：ATCC6538分別為98.5%、96.9%、100.0%；ATCC25923分別為96.6%、101.4%、100.7%。見表1。三種選擇性培養基的回收率差異無統計學意義（P>0.05）。

2.2 選擇性培養基目標菌株的檢測效率

2株金黃色葡萄球菌標準菌株在三種不同選擇性培養基上生長情況分別為：在BP培養基上培養18～24 h時，菌落較小，黑色，無暈圈，生長沒有呈現典型菌落特征或者特征表現不明顯，培養至48 h后菌落呈現典型生長形態，黑色，有暈圈；在RPF培養基上培養18 h后，菌落黑色、稍有沉淀環，培養24 h后呈現典型性狀；在 CHROMagarTMStaph aureus培養基上培養18 h時菌落呈粉紅色至紫紅色，24 h后菌落均呈紫紅色?？梢钥闯?，CHROMagarTMStaph aureus培養基和RPF培養基對目標菌株檢測效率優于BP培養基，菌落呈現典型特征的速度快、生長好，兩種培養基檢測所需時間比使用BP培養基縮短24 h左右（表2）。又因RPF培養基里含有兔血漿，所以，在RPF培養基上生長的典型金黃色葡萄球菌不需再做血漿凝固酶就可確認，縮短菌株鑒定時間6 h左右。

2.3 選擇性培養基的敏感性、特異性

在BP、RPF、CHROMagarTMStaph aureus三種選擇性培養基上反映40株金黃色葡萄球菌相應的典型菌落生長（敏感性）分別為90.0%（36/40）、95.0%（38/40）和97.5%（39/40）；50株非金黃色葡萄球菌的非典型菌落（特異性）分別為92.0%（46/50）、100.0%（50/50）和96.0%（48/50）。其中BP培養基有2株表皮葡萄球菌、1株溶血葡萄球菌、1株沃氏葡萄球菌出現假陽性菌落，CHROMagarTMStaph aureus培養基上有1株無乳鏈球菌、1株藤黃微球菌生長出假陽性菌落。RPF培養基未出現假陽性菌落，測試結果表明CHROMagarTMStaph aureus培養基對金黃色葡萄球菌的敏感性最高，RPF培養基的特異性最高。見表3。

2.4 食品樣品檢測

2017年1月—4月在上海市食品超市、農貿市場采集銷售的調理肉制品、熟肉制品、生牛奶等食品共計243份，按照GB 4789.10—2016標準增菌后，分別劃線接種于BP、RPF、CHROMagarTMStaph aureus培養基，共有25件樣品檢出金黃色葡萄球菌，總檢出率為10.3%（25/243）。其中BP、RPF、CHROMagarTMStaph aureus培養基對目標菌的檢出率分別為8.2%（20/243）、9.5%（23/243）和9.9%（24/243）；敏感性分別為80%（20/25）、92%（23/25）和96%（24/25）；特異性分別為94.0%（205/218）、98.6%（215/218）和96.3%（210/218） 。實驗結果表明，CHROMagarTMStaph aureus培養基對樣品中金黃色葡萄球菌的檢出率最高；RPF培養基假陽性率最低；BP培養基的檢測敏感性、特異性較其他2種培養基差。見表4 。

3 討論

在選擇性增菌后使用分離培養基進行目標菌的分離鑒定是目前金黃色葡萄球菌檢驗的關鍵步驟之一。由于不同的分離培養基應用的原理不一樣，檢測方法的適用性、檢測人員技術差異等因素，對各種分離培養基做好實驗室質量控制和應用評估非常重要。

本次實驗顯示，3種選擇性培養基的回收率都達到95%以上。表明3種選擇性培養基性能相當，方法可靠。從檢測效率方面看，RPF、CHROMagarTMStaph aureus培養基在實驗中呈現典型菌落的時間短、生長好，檢測所需時間比使用BP培養基縮短24 h左右，RPF培養基更可縮短菌株鑒定時間6 h左右；RPF、CHROMagarTMStaph aureus培養基的檢測效率明顯高于BP培養基。另外，使用CHROMagarTMStaph aureus培養基對檢測人員要求不高，只要通過簡單的觀察菌落形態、顏色，就可進行檢測。而傳統的BP培養基觀察判斷結果時對檢測人員經驗（目標菌辨別能力）要求較高，所以顯色培養基操作簡單，能克服因人員的差異造成實驗的假陰性現象。

分離培養基對目標菌的敏感性反映了方法可能存在的假陰性情況，3種培養基在對實驗室分離株測試的敏感性均達到90%以上，但在對實際樣品測試時，3種培養基敏感性都有不同程度的下降，BP培養基尤為明顯（80%）。這可能和食品成分復雜、培養基雜菌生長多、抑制目標菌生長有關；BP培養基的抑菌性能相對更差，非目標菌株，如變形桿菌、芽胞桿菌的生長都會影響目標菌的檢出[7，9]。這個觀點從BP培養基對食品中金黃色葡萄球菌的檢出率為8.2%，比RPF（9.5%）、CHROMagarTMStaph aureus（9.9%）要低的實驗結果中得到驗證。

分離培養基對目標菌的特異性直接反映方法假陽性情況。實驗表明，BP培養基上有2株表皮葡萄球菌、1株溶血葡萄球菌、1株沃氏葡萄球菌出現假陽性菌落，CHROMagarTMStaph aureus培養基有1株無乳鏈球菌、1株藤黃微球菌生長出假陽性菌落，RPF培養基在此次實驗中未出現假陽性菌落。但有報道稱RPF培養基檢測金黃色葡萄球菌的假陽性率為1%，主要來自中間葡萄球菌[5，10]。

此次實驗顯示，RPF、CHROMagarTMStaph aureus培養基在測試菌株敏感性和特異性方面均優于BP培養基，但是沒有一種選擇型培養基的敏感性、特異性達到100%，在實驗過程中僅僅采用單一的選擇性培養基，不可避免會有漏檢的風險。因此，采用多種選擇性培養基是避免漏檢現象發生的可行而有效的方法。建議將RPF、CHROMagarTMStaph aureus培養基作為一種可靠的檢測技術應用于食品中金黃色葡萄球菌的分離檢測。

參考文獻

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