普奈洛爾抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究

徐永飛　武海龍　趙哲媛　石英光

[摘要]目的：探討普奈洛爾抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制。方法：選擇本院瘢痕疙瘩患者病理組織，分離培養(yǎng)，獲取成纖維細(xì)胞，并分別于含有普萘洛爾的培養(yǎng)基（實(shí)驗(yàn)組）和單純培養(yǎng)基（對(duì)照組）中進(jìn)行培養(yǎng)，應(yīng)用CCK-8法檢測(cè)兩組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，酶標(biāo)儀檢測(cè)450-630nm的吸光度值。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)能力明顯受到抑制，且吸光度值明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：普萘洛爾可明顯抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，為整形外科中瘢痕疙瘩的預(yù)防及治療提供了新方向。

[關(guān)鍵詞]瘢痕疙瘩；成纖維細(xì)胞；普萘洛爾；生長(zhǎng)曲線

[中圖分類號(hào)]R619⁺.6 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2018）02-0091-03

瘢痕疙瘩常繼發(fā)于皮膚傷口的不良愈合，不僅影響美觀，常可伴發(fā)局部感覺異常，嚴(yán)重者甚至可形成局部破潰，嚴(yán)重影響患者身心健康。普萘洛爾常用于整形外科中血管瘤的治療，其在抑制血管瘤侵襲性生長(zhǎng)方面，療效顯著。基于此，DE Mesquita CJ曾大膽假設(shè)將普萘洛爾應(yīng)用于瘢痕疙瘩的治療，并做了大量的臨床實(shí)驗(yàn)。本研究主要從普萘洛爾對(duì)瘢痕疙瘩的生物學(xué)特性方面出發(fā)，明確其影響瘢痕組織成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)藥品及試劑：鹽酸普萘洛爾片（東北制藥生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字HP1021682），PBS液，0.075%Ⅱ型膠原酶，10%FBS，低糖DMEM，胎牛血清，DMEM培養(yǎng)基，青鏈霉素，0.25%胰蛋白酶，二甲基亞砜（DMSO）溶液，PBS溶液。

1.2瘢痕疙瘩組織：瘢痕疙瘩組織來(lái)源于本院整形外科瘢痕疙瘩切除患者，并經(jīng)病理證實(shí)，且所有患者對(duì)本研究知情并簽署相關(guān)知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者6個(gè)月內(nèi)病變組織無(wú)破潰、感染及癌變等；②患者6個(gè)月內(nèi)未口服抗瘢痕藥物或激素類藥物；③患者6個(gè)月內(nèi)未接受放射治療；④無(wú)精神性疾病及相關(guān)器質(zhì)性疾病者。

2方法

2.1瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的制備：用PBS液沖洗所獲取的脂肪組織，用Ⅱ型膠原酶消化獲取脂肪顆粒，過(guò)濾上清液及未消化的脂肪組織，并放入離心機(jī)中以1200r/min離心10min，得到單核細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至104個(gè)細(xì)胞/ml，進(jìn)行培養(yǎng)，獲取所取種子細(xì)胞，并進(jìn)行免疫鑒定。

2.2實(shí)驗(yàn)分組：根據(jù)培養(yǎng)基不同，將實(shí)驗(yàn)分為2組，實(shí)驗(yàn)組為含有50ng/L普萘洛爾的培養(yǎng)基；對(duì)照組為單純培養(yǎng)基。將獲取的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞分別放入兩組培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，48h后，兩組培養(yǎng)基中分別加入10ul的CCK-8液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。

2.3檢測(cè)指標(biāo)：使用酶標(biāo)儀檢測(cè)兩組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子450～630nm的吸光度值，吸光度值越高，表明瘢痕成纖維細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)；并連續(xù)檢測(cè)其7d生長(zhǎng)曲線，從而明確普萘洛爾對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)能力的影響。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞鑒定結(jié)果：利用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，可見瘢痕成纖維細(xì)胞表面標(biāo)記物CD73、CD90及CD105均為陽(yáng)性，表達(dá)率較高，說(shuō)明細(xì)胞具有成纖維細(xì)胞特性。結(jié)果見圖1。

3.2一般形態(tài)學(xué)觀察：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)目較少，體積較小，排列疏松，呈梭形或長(zhǎng)方形，核小，輪廓清晰；對(duì)照組細(xì)胞數(shù)目較多，體積較大，排列緊密，呈突出的紡錘形或星形扁平細(xì)胞，核大，輪廓清晰。

3.3兩組瘢痕成纖維細(xì)胞吸光度值檢測(cè)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組瘢痕成纖維細(xì)胞吸光度值明顯小于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），觀察組瘢痕成纖維細(xì)胞增殖能力較差。見表1。

3.4兩組瘢痕成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線：兩組細(xì)胞總體生長(zhǎng)趨勢(shì)大致相同，第1～2天生長(zhǎng)緩慢，第3～4天生長(zhǎng)迅速，第5天達(dá)到高峰，第6～7天相對(duì)平穩(wěn)，形成一個(gè)平臺(tái)期。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)能力明顯低于對(duì)照組。見圖2。

4討論

瘢痕疙瘩與普通瘢痕不同，常突出于體表，且不穩(wěn)定，不僅影響美觀，甚至局部可出現(xiàn)疼痛、瘙癢等不適癥狀，影響工作和休息，其無(wú)法自行消失，長(zhǎng)期存在可發(fā)生破潰，嚴(yán)重影響患者身心健康。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者比較認(rèn)可的發(fā)病機(jī)制是組織細(xì)胞的功能異常，即成纖維細(xì)胞的過(guò)度增殖，成纖維細(xì)胞是瘢痕疙瘩發(fā)生的始動(dòng)細(xì)胞，也是形成肉芽組織、合成膠原等細(xì)胞外基質(zhì)、進(jìn)行傷口重塑的重要細(xì)胞，它通過(guò)活化、增殖、合成膠原來(lái)修復(fù)創(chuàng)面，可一旦成纖維細(xì)胞的功能發(fā)生異常將導(dǎo)致瘢痕疙瘩的形成。瘢痕疙瘩的治療是臨床上的難題，單一的治療方法效果差，臨床上治療瘢痕疙瘩的方法有手術(shù)切除、放療、局部注射藥物、激光治療、壓力療法以及聯(lián)合治療等，國(guó)內(nèi)外學(xué)者一致認(rèn)為聯(lián)合療法的效果較單一療法好。目前瘢痕內(nèi)注射藥物在治療瘢痕疙瘩中起到了重要作用。因此對(duì)于瘢痕疙瘩，早期干預(yù)，使瘢痕疙瘩喪失生長(zhǎng)的始動(dòng)力，尤為重要。

普萘洛爾最早應(yīng)用于整形外科中嬰幼兒血管瘤的治療，其機(jī)制可能與抑制血管瘤成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)，普萘洛爾作為常用的β受體拮抗劑，具有抑制膠原蛋白形成、抗纖維化作用，其作用機(jī)理是通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制TGF-β、受體，從而抑制了成纖維細(xì)胞的生物學(xué)活性，減少膠原分泌，達(dá)到抗纖維化的效果。

本研究探討了普耐洛爾抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)，從而抑制瘢痕疙瘩生長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)標(biāo)本來(lái)源于本院瘢痕疙瘩患者，并經(jīng)病理證實(shí)，采用中性蛋白酶消化分離瘢痕表皮細(xì)胞，避免表皮細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來(lái)干擾，進(jìn)一步傳代培養(yǎng)，將所獲得的種子細(xì)胞應(yīng)用其特異性標(biāo)志物進(jìn)行鑒定，從而保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。將含有50ng/L普萘洛爾的培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組選用單純培養(yǎng)基，通過(guò)繪制兩組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，并測(cè)定第1～7天吸光度值來(lái)反應(yīng)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞均呈S形生長(zhǎng)，但實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)能力明顯低于對(duì)照組，且實(shí)驗(yàn)組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞吸光度值明顯低于對(duì)照組，進(jìn)一步證明，普萘洛爾可在一定程度上抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，從而抑制瘢痕疙瘩的生長(zhǎng)及其纖維化，為臨床上瘢痕疙瘩的預(yù)防及治療提供了新方向，但本研究?jī)H僅通過(guò)細(xì)胞方面的基礎(chǔ)研究提供理論支持，要全面應(yīng)用于臨床，有待于進(jìn)一步的臨床實(shí)驗(yàn)研究。

[收稿日期]2017-09-27 [修回日期]2017-11-20

編輯/朱婉蓉