乳液聚合法制備PMMA/CS殼核納微球的研究*

★高淑婷 張媛媛 乾康 萬喜 劉偉婷 尹小英（.江西中醫藥大學藥學院 南昌330004；.江西省中醫藥研究院 南昌　330046；3.上海工程技術大學化學化工學院 上海　060）

殼聚糖來源于一種用途廣泛的生物材料甲殼素，這是一種廣泛存在于蟹、蝦殼中的多糖，在自然界有巨大的儲存量［1］。殼聚糖現已廣泛用于開發納米材料，殼聚糖納米粒的研究也成為熱點，如包埋、吸附藥物、核酸、蛋白質或者是酶活性方面的應用［2-3］。聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）是具有無定型結構的聚合物，具有良好的機械穩定性和良好的硬度［4］。在引發條件下殼聚糖與PMMA發生乳液聚合反應可在水溶液中形成殼核納米粒，該納米粒兼具良好機械性和生物相容性。

本實驗在不使用乳化劑條件下，可制備得到PMMA/CS殼核納米微球。在實驗中，我們以氮氣為保護劑，過硫酸銨（APS）作為引發劑，引發甲基丙烯酸甲酯（MMA）與殼聚糖的接枝共聚反應，合成納米微球。研究了乳液聚合過程中溫度、APS含量、MMA與CS質量配比對殼核納米粒的粒徑的影響并測定了粒徑分布（PDI）、表面電位（zeta電位），然后通過三因素三水平正交試驗分析了三因素對乳膠粒接枝率、接枝效率的影響。制備出大小均一，形貌較好，接枝率和接枝效率較高的納米微球。同時本實驗還考察了納米粒對藥物的負載和釋放行為。

1　材料與設備

1.1試劑 殼聚糖（CS）、甲基丙烯酸甲酯（MMA）（上海阿拉丁試劑有限公司）；過硫酸銨（APS）、冰醋酸（西隴化工股份有限公司）；苦參堿（南京普怡股份有限公司）；二次蒸餾水自制。

1.2儀器 DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（杭州瑞佳精密科學儀器有限公司）；BS214D型電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；Malvem納米粒度儀（英國馬爾文公司）；掃描電鏡（德國）；透析袋（截留相對分子質量12000～14000）；DZF-6020型真空干燥箱（杭州瑞佳精密科學儀器有限公司）。

2　方法與結果

2.1殼聚糖的純化 精密稱取10g殼聚糖溶于500mL醋酸溶液（1%v/v）中，過夜，室溫攪拌條件下用10g/L的氫氧化鈉溶液調至pH=9析出，過濾，蒸餾水洗滌沉淀至pH=7，60℃真空干燥備用。

2.2PMMA/CS殼核納米微球的制備 分別精密稱取0.3g已純化的殼聚糖，溶于30mL醋酸溶液（1%v/v）中，將溶液轉入置于水浴鍋并配備有溫度計，冷凝管，磁力攪拌器，氮氣入口的三口燒瓶中。升溫至40℃使殼聚糖充分溶解，通氮氣除去瓶中的氧氣和二氧化碳。向燒瓶中加入一定量的MMA，通氮氣30min，升溫至一定溫度。將不同量的APS分別添加到混合物中，在一定的溫度下氮氣保護攪拌3.5h。反應結束后，冷卻，透析48h（透析袋截留相對分子量為12000～14000），除去未反應的MMA單體、MMA均聚物等雜質。離心（13000r/min）10min，去除上清液，50℃烘干至恒重。接枝率和接枝效率按下式計算：

接枝率=（m1-m0）/m0×100%

接枝效率=（m1-m）/m2×100%

式中：m0、m1、m2分別指CS、PMMA/CS微球和加入的MMA的質量。

2.3單因素實驗與正交實驗設計 首先分別考慮溫度、MMA與CS的配比，APS的濃度對PMMA/CS納米微球粒徑的影響并測定其PDI、Zeta電位，然后根據單因素實驗結果，設計正交試驗因素與水平，列出正交實驗因素與水平表1。

表1　因素與水平表

2.4測試表征 粒徑分析：取適量干燥納米粒粉末，加入適量蒸餾水超聲分散30min成混懸液，采用Malvem公司Zetasizer Nano ZS90型納米粒度與Zeta電位分析儀對粒度、粒度分布指數（PDI）、Zeta電位測定。納米粒形貌表征：滴一滴納米混懸液于載體玻片上，自然晾干后，噴金后用掃描電鏡觀測其形貌；紅外光譜定性。

2.5溫度對PMMA/CS納米粒的影響 稱取已純化的殼聚糖0.3g溶于1%醋酸30mL，MMA與CS的質量配比為2∶1，加入APS的含量為0.009g，反應時間3.5h，固定這些條件不變，按2.2步驟，在不同溫度下反應，研究其對聚合乳膠粒的影響，結果見表2。

表2　溫度對納米粒性能的影響

從表中數據可知在這4個溫度下，均有納米粒合成，其中在65℃、70℃、75℃下，溫度對納米粒的平均粒徑的影響不大，并且粒徑分布較為均勻，納米粒的表面電位也在30mv左右，表明體系較為穩定。但在溫度為80℃時，由于溫度過高限制了APS與MMA和CS的接枝共聚反應引起接枝率低，粒徑較小，干燥后納米粒黏連，導致測得的粒徑偏離正常值。

2.6MMA/CS配比對PMMA/CS納米粒的影響 稱取已純化的殼聚糖0.3g溶于30mL的1%醋酸，加入APS的含量為0.009g，在70℃反應，反應時間3.5h，固定這些條件不變，按2.2步驟，僅改變MMA與CS質量比，研究其對聚合乳膠粒的影響，結果見表3。

表3　MMA/CS配比對納米粒性能的影響

從表中數據可知，納米粒的粒徑在150～250nm之間，并且PDI值都在0.3以下，表明粒徑分布較為均勻，Zeta電位都在30mv左右，體系較為穩定。2.7 APS濃度對PMMA/CS納米粒粒徑的影響 稱取已純化的殼聚糖0.3g溶于30mL的1%醋酸，MMA與CS的質量配比為2∶1，在70℃反應，反應時間3.5h，固定這些條件不變，按2.2步驟，改變APS的含量，研究其對聚合乳膠粒的影響，結果見表4。

表4　APS濃度對納米粒性能的影響

2.8正交實驗法研究PMMA/CS納米粒微球 在單因素結果基礎上，根據所列正交實驗表進行九組實驗，得到實驗結果見表5。

表5　正交實驗結果

2.8.2 正交實驗結果的極差分析見表6。

表6　正交實驗結果極差分析

圖1　PMMA/CS殼核納米微球的SEM照片

圖2　PMMA/CS納米粒紅外光譜圖

2.9PMMA/CS納米微球負載苦參堿及藥物釋放考察

2.9.1PMMA/CS納米微球負載苦參堿 取20mg苦參堿置于20mL棕色容量瓶中，用PBS=7.4的緩沖溶液定容。取1mL的苦參堿溶液，將與4mL的納米微球溶液（0.5g/mL）在25℃下快速混合2h，然后將混合液置入透析袋（10000～14000）中，用50mL二次蒸餾水透析2h。通過紫外分光光度計在波長為208nm處檢測透析液中游離藥物的吸光值，與標準曲線對照并計算出質量，即未被負載苦參堿的質量，計算出負載率為57.4%。

標準曲線制作：將濃度分別為0、5、10、15、20、25μg/mL的苦參堿溶液置于波長為208nm的紫外分光光度計中測吸光度，計算其線性關系為Y=0.0364X+0.0077，r=0.9994.

負載率=（M0-M1）/M0×100%（M0是苦參堿的總質量，M1是未被負載苦參堿質量）

2.9.2PMMA/CS納米微球負載苦參堿的藥物釋放測試 采用透析法考察負載苦參堿的納米粒在PBS=7.4中的釋放度。將洗去未被負載苦參堿的載藥納米粒置于透析袋（10000～14000）中，在25℃50mL的PBS=7.4溶液中釋放介質。并在不同的時間取樣測吸光度，計算釋放率，見圖3。可以看出苦參堿溶液在45min的時候釋放率達到90%而被納米粒負載的苦參堿在16h才接近90%，表明PMMA/CS對苦參堿的負載可延緩藥物釋放。

圖3　負載苦參堿的PMMA/CS納米粒與苦參堿溶液體外釋放曲線

3　討論

APS和CS上的氨基構成氧化還原體系，引發MMA在CS上的接枝共聚反應，紅外圖（見圖2）可看出，1725cm-1，1149cm-1有明顯吸收，表明MMA已接枝上去。由于PMMA的憎水性和CS的親水性使其在水溶液中形成了微球型。本實驗首先對其形成微球型進行單因素實驗，結果表明溫度、APS含量、MMA與CS質量配比對殼核納米粒的粒徑有一定的影響。并進行正交試驗和對正交結果進行極差分析發現對接枝率和接枝效率影響為：配比＞APS含量＞溫度；且表明5號接枝率和接枝效率都是最高的，粒徑為217.5nm，PDI值為0.02，Zeta電位為34.4±7.11；SEM照片可看出合成的納米微球形貌皆為有殼核的球，粒徑大小都較為均一，分散性較好。因此在溫度為70°，APS含量為0.018g，MMA/CS配比為10時，可獲得性能較好，接枝率為88.1%，接枝效率為74.2%的納米粒，并將其用于負載苦參堿和藥物釋放度測試，結果良好。綜上所述，本研究確定了可形成穩定，大小均一，黏連度低的合成PMMA/CS微球的條件，且該方法簡便，成本低。并且使用水溶性的無機物引發劑比使用有機油性引發劑更容易除去，減小殘留物，更有利于此PMMA/CS納米微球作為酶固定化的載體或藥物載體。

［1］王芳寧,孫賓賓,周怡婷,等, 過硫酸銨引發丙烯酸甲酯接枝羧甲基甲殼素共聚[J].化學與生物工程, 2007, 24(6):18-20.

［2］Montri Ratanajanchai, Sunhapas Soodvilai,Nuttaporn Pimpha et al.Polyethylenimine-immobilized core-shell nanoparticles: synthesis,characterization, and biocompatibility test [J]. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl, 2014, 34(1):377-83.

［3］Inphonlek S, Pimpha N, Sunintaboon P. Synthesis of poly(methyl methacrylate) core/chitosan-mixed-polyethyleneimine shell nanoparticles and their antibacterial property [J]. Colloids and Surfaces B:Biointerfaces, 2010, 77(2):219-226.

［4］Lee K D, Jeong Y I, Kim D H, et al. Cisplatin-incorporated nanoparticles of poly(acrylic acid-co-methyl methacrylate) copolymer [J]. Int J Nanomedicine, 2013(8):2 835-2 845.